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보고서 초록
요약문
SUMMARY
CONTENTS
목차
제1장 연구개발과제의 개요 10
1. 연구개발의 목적 10
2. 연구개발의 배경 및 필요성 10
1) 연구개발의 배경 10
2) 연구개발의 필요성 13
제2장 국내외 기술개발 현황 14
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 15
1. Aurora kinase의 인산화 표적 단백질 및 결합단백질로 발굴된 후보 단백질의 기능적 연구 15
1) 연구 수행 방법 (이론적, 실험적 접근 방법) 15
2) 연구 내용 및 결과 16
2. Complex proteomics를 통해서 발굴된 polo-like kinase 1(Plk1)의 새로운 결합단백질 TNKS1의 기능적 연구 27
1) 연구 수행 방법 (이론적, 실험적 접근 방법) 27
2) 연구 내용 및 결과 27
3. 새로 발굴한 포스파타제 Ssu72의 cohesin complex에 관련한 기능적 연구 34
1) 연구 수행 방법 (이론적, 실험적 접근 방법) 34
2) 연구 내용 및 결과 34
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 45
제5장 연구개발결과의 활용계획 46
제6장 참고문헌 47
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I. 제목
Aurora kinase와 Plk1의 표적/결합단백질 발굴과 기능 연구를 통한 위암 및 간암세포의 분열 제어 기술 연구
II. 연구개발의 목적 및 필요성
가. 연구 개발의 목적
발암성 유사분열 특이 인산화효소 (Aurora kinases, Plk1)의 인산화 표적단백질 및 결합단백질을 발굴하여 기능적 연구를 수행하고, 이들 인산화효소와 후보결합/표적단백질의 종양 진단의 새로운 표식자로서 그리고 항암의 분자적 표적으로서 가능성을 평가함으로서 위암 및 간암세포에서 Aurora-A, Aurora-B 그리고 Plk1의 활성을 선택적으로 통제할 수 있는 기반 기술을 구축하고자 함.
나. 연구 개발의 필요성
다양한 유전적 및 비유전적 요인에 의한 세포주기 조절의 오류는 비정상적인 세포분열을 유도함으로써 암 발생과 직접 관련되어 있다. 지금까지의 항암제는 암세포의 비정상적인 증식을 억제하거나 사멸을 유도하는데 초점을 두고 개발되어 왔다. 그러나 기존의 다양한 치료법은 암세포뿐만 아니라 정상세포의 증식억제와 세포사멸을 유도하는 치명적인 부작용을 유발하고 있다. 최근에 차세대 항암제 개발의 표적으로서 Aurora kinases와 Polo-like kinase 1의 활성을 억제하는 화합물의 탐색 및 발굴에 많은 다국적 제약회사들이 역량을 결집하고 있다. 그럼에도 불구하고 이들 인산화효소의 활성을 조절하는 기전은 무엇이며, 비정상적인 과발현에 의한 인산화의 표적단백질은 무엇인지, 그리고 활성을 선택적으로 제어 할 수 있는 기술에 대해서는 아직 구체적으로 보고된 바 없다.
III. 연구개발의 내용 및 범위
(1) 1차년도
ㆍ Aurora-A, Aurora-B 그리고 Plk1의 발현을 선택적으로 억제하는 위암 및 간암세포주 구축
ㆍ Aurora-A, Aurora-B 그리고 Plk1의 인산화 표적단백질의 발굴 및 기능적 분석
ㆍ Kinase-substrate 상호간 결합의 구조적 특성 분석
(2) 2차년도
ㆍ Aurora A, Aurora B 그리고 Plk1의 새로운 결합단백질을 complex proteomics 분석을 통하여 발굴
ㆍ 상호간의 결합에 의한 modification 및 후보 단백질들의 in vitro/in cell-based kinase assay, 그리고 염색체의 분리 및 구조적 변화 분석
ㆍ 후보 표적단백질의 항체 제작
(3) 3차년도
ㆍ 다양한 위암 및 간암세포주를 이용한 후보 결합 및 표적 단백질들의 발암 관련 인자로서의 진단적 가치 평가
ㆍ 구축된 후보 표적단백질의 유전자의 발현억제 세포주를 이용한 mitotic defects, 세포내 유전체의 안정성 및 transforming activity 분석
(4) 4차년도
ㆍ 새로운 결합 및 인산화 표적유전자의 rAd-siRNA 시스템과 과발현 시스템을 이용한 tumor formation 및 regression 그리고 암세포 증식 및 사멸 그리고 chemosensitizer로써의 활용 가능성 평가
ㆍ 선별된 후보 결합 및 인산화 표적단백질의 cell-based/ in vivo 억제제 탐색시스템의 구축
IV. 연구개발결과
(1) Aurora kinase의 인산화 표적 단백질 및 결합단백질로 발굴된 후보 단백질의 기능적 연구
ㆍ Aurora-A, Aurora-B 그리고 Plk1의 발현을 선택적으로 억제하는 위암 및 간암세포주 구축.
ㆍ 2D-SDS-PAGE 이용하여 분석한 결과 Aurora-A후보 결합단백질로 PTTG 1, BX4를 발굴하였음.
ㆍ Aurora-A후보 결합단백질로 GR 1을 발굴함.
(2) Complex proteomics를 통해서 발굴된 Polo-like kinase 1 (Plk1)의 새로운 결합 단백질 TNKS1의 기능적 연구
ㆍ 발굴된 TNKS1이 Plk1과 결합하는 것을 확인함.
ㆍ TNKS1이 유사분열동안 centrosome에 Plk1와 co-localization하는 것을 관찰함.
ㆍ TNKS1은 Plk1에 의해 인산화되며 단백질의 stability도 조절됨.
ㆍ TNKS1이 Plk1에 의해서 PARsylation이 조절받는 것을 확인함.
ㆍ Plk1 inhibitor를 처리하여 FISH 분석 실험을 수행한 결과 Plk1이 telomere를 조절하는 것을 규명함.
(3) 새로 발굴한 포스파타제 Ssu72의 cohesin complex에 관련한 기능적 연구
ㆍ 탐색된 Ssu72가 기존에 알려진 cohesin complex와 결합함을 확인함
ㆍ Aurora-B와 Plk1에 의해 phosphorylation 되어진 Ssu72는 cohesin complex와의 결합과 phosphatase활성이 소실됨을 관찰함.
ㆍ shRNA를 이용하여 Ssu72의 발현 억제는 chromosome arm의 cohesin을 비정상적으로 분해를 가속화시킴을 확인함
V. 연구개발결과의 활용계획
새로운 후보 항암의 표적으로서 그 가능성이 매우 높게 평가되고 있는 Aurora kinases와 Polo-like kinase 1의 활성 및 기능 조절에 대한 연구는 세계적으로도 매우 미진한 상태임. 본 과제에서는 Aurora kinases와 Polo-like kinase 1의 새로운 결합단백질 및 인산화의 기질단백질을 탐색하고 기능 연구를 수행함으로써 anti-cancer theraphy의 분자적 모델을 구축하고 새로운 anti-cancer의 표식/표적 유전자를 발굴할 가능성이 매우 높다고 판단함. 새로운 항암 표적인자로서의 가치 조명 및 Aurora-A, Aurora-B와 Plk1의 과발현에 의한 항암제 저항성 극복을 위한 새로운 방안을 제시하고자 함. Aurora-A, Aurora-B 또는 Plk1과 새로운 조절/표적단백질간의 상호 결합을 통제하는 lead를 발굴하는데 적용될 것임.
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