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보고서 초록
요약문
SUMMARY
CONTENTS
목차
제1장 연구개발과제의 개요 10
제1절 연구개발의 목적 10
제2절 연구개발의 필요성 10
제3절 연구개발의 범위 12
제2장 국내외 기술개발 현황 13
제1절 국내·외 관련분야에 대한 기술개발현황 13
제2절 연구결과가 국내·외 기술개발현황에서 차지하는 위치 13
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 14
제1절 이론적, 실험적 접근방법 14
제2절 연구 내용 16
제3절 연구결과 17
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 117
제5장 연구개발결과의 활용계획 119
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 120
제7장 참고문헌 120
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I. 제목
식물 칼슘신호전달 관련 유전자들의 기능 분석
II. 연구개발의 목적 및 필요성
본 연구의 장기적 목적은 어떻게 칼슘이온이 다양한 외부신호를 받아 효소활성과 유전자발현을 통해 세포의 성장과 분화를 조절하는지 밝히는 것이다. 유전학적인 방법을 이용 Ca2+ 신호 전달의 중요 구성원들을 찾고 생화학 및 세포생물학적인 방법으로 그 구성원들의 작용 기작을 이해하는 것이다. 단기적인 목적은 첫째, 세포의 칼슘 농도 항상성을 조절하는 유전자들의 기능과 항상성 유지가 세포의 성장, 발달, 스트레스 인식과 신호전달에 미치는 영향을 조사하는 것이다. 식물세포의 가장 중요한 칼슘 저장소인 액포의 칼슘 펌프가 돌연변이를 이용하여 칼슘 항상성 조절이 식물세포에 미치는 영향을 연구하고자 하였다. 둘째, 칼슘농도 증가에 의해서 활성화되는 대표적인 칼슘 결합 단백질인 calmodulin에 의한 신호전달과정을 밝힘으로서 여러 가지 신호전달이 어떻게 해석이 되고 전달이 되는지를 밝히는 것이었다. 오랜 연구에도 불구하고 여전히 칼슘 농도조절의 중요성과 조절 기작에 대해서는 명확히 밝혀진 것이 없으며 많은 궁금한 점을 풀지 못하고 있으며 칼슘 이온의 증가 후에 어떤 경로를 통해서 신호가 전달이 이루어지며 조절되는지 별로 밝혀진 것이 없다고 볼 수 있다. 본 연구에서는 여러 CaM 결합 단백질 중에서 전사조절인자인 NAC과 AS1전사조절인자들과 수용체인 receptor like protein, 탈인산화 효소인 DsPTPl 등의 생화학적인 특성과 생리학적 기능에 대한 연구를 수행하였다.
III. 연구개발의 내용 및 범위
1. vacuole mediated cell death와 칼슘 항상성과의 상호 관련성 연구: vacuole Ca2+ pump mutant들에서의 cell death가 칼슘 매개된 vacuole의 파괴를 통해서 이루어짐을 밝힘.
2. 내병성 유전자의 발현을 조절하는 CaM 결합 전사조절인자(NACl)의 기능 연구: NACl mutant에서 PR gene 발현이 증가됨을 밝히고 NACl이 PR gene 발현의 negative regulator임을 증명할 것임.
3. MAPK signaling을 조절하는 CaM 결합 protein phosphatase(DsPTPl)의 기능 구명: DsPTPl가 스트레스 신호전달에 관여하는 특정 MAPK와 interaction하고 그 활성을 조절함을 in vitro와 식물체 내에서 밝히고자 함.
4. 잎의 발달에 관여하는 ASl(assymetric leafl)과 CaM 상호작용 연구: CaM이 잎의 발달에 관여하는 단백질의 활성을 조절함을 밝힘.
IV. 연구개발결과
1. 모델 식물인 Arabidopsis를 이용하여 식물 세포에서의 칼슘 농도 항상성 조절 기작에 관여하는 액포 Ca2+-ATPase 유전자들의 돌연변이를 분리하고 그들의 표현형을 조사 분석하였다. 연구 결과 액포에 있는 Ca2+-ATPase mutant가 ABA와 Ca2+을 잘 인식하지 못하였고, 액포에 있는 두 개의 Ca2+-ATPase 유전자가 knock-out 된 mutant는 세포사멸의 표현형을 보여 주었다. 이로서 액포 주위의 칼슘 농도 항상성이 세포의 생명 유지와 스트레스 신호전달에 매우 중요함을 보여주고 있다.
2. 병원균에 발현 유도되는 receptor-like kinase(RLK)를 분리하여 박테리아에서 발현하여 kinase로서의 여러 가지 생화학적인 특성을 연구하였다. 또한, RLK이 형질전환체와 KO된 식물체를 이용하여 생리학적 기능을 연구하였다. 돌연변이 식물체를 이용하여 병저항성을 조사하였을 때 세균병 저항성이 감소하였고, 형질전환식물체에서는 세균병 저항성이 증가하였다. 또한, 돌연변이 식물체에서는 PR-1 gene의 발현이 WT과 비교하여 증가하고 형질전환식물체에서는 PR-1 gene의 발현이 WT과 비교하여 감소하는 것으로 확인함으로써 RLK 단백질은 PR-1 gene 발현의 negative regulator임을 예상할 수 있었다.
3. CaM 결합 단백질 중의 하나인 Dual Specific Protein Phosphatase (DsPTPl)를 분리하여 생체내의 기능을 확인하고자, 이 단백질과 결합하는 또 다른 단백질을 연구하였다. 흥미롭게도 기존에 스트레스 신호전달에 관여하는 MPK3, MPK4, MPK6를 분리하였다. In vitro상에서 DsPTPl은 결합 단백질인 MPK3, MPK4, MPK6를 항인산화 작용을 통해 비활성 시키는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 CaM은 이러한 DsPTPl의 효소 활성을 저해 하였으며, 특이적으로 Tyr 아미노산의 항인산화 효소 활성만을 저해하였다.
4. CBNAC이 발현되지 않는 cbnacl 돌연변이 식물체와 CBNAC의 과발현 식물체를 구축하여 병원성 박테리아를 처리하여 식물체의 변화를 관찰해 보았다. 그 결과 wild-type에 비해 cbnacl 돌연변이 식물체에서는 병원성 박테리아의 성장이 감소하는 병원균에 대한 저항성이 증가하는 현상을 관찰할 수 있었다. 반면 CBNAC 과발현 식물체는 wild-type에 비해 병원성 박테리아의 성장이 증가하는 감소된 병 저항성을 보였다. PR1유전자의 발현이 cbnacl 돌연변이 식물체에서는 증가하고, CBNAC 과발현 식물체에서는 wild-type에 비해 PR1 유전자의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 CBNAC 단백질은 병원성 박테리아에 대한 식물의 병 저항 관련 유전자의 발현을 억제하는 역할을 수행하는 전사 조절인자라는 것을 알 수 있었다.
V. 연구개발결과의 활용계획
본 연구에서 수행한 돌연변이체의 분석과 식물 칼슘 신호전달 관련 유용유전자를 확보하고 유용형질을 가진 몇몇과 이들의 분석을 통하여 유용유전자들을 확보하였다. 이렇게 확보된 유전자는 신기술에 대한 지적 재산권(특허화)을 확보하여, 내병성 및 환경스트레스 내성식물 개발연구에 사용되어질 것이다. 또한, 이렇게 개발된 식물체는 궁극적으로는 우수품종의 확보에 의한 국가 경쟁력 확보 분야에 이용되어 질것이다.
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