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보고서 요약서

요약문

SUMMARY

CONTENTS

목차

제1장 연구개발과제의 개요 15

제1절 연구 개발의 목표 15

제2절 연구개발의 필요성 15

제3절 연구개발의 범위 16

제2장 국내외 기술개발 현황 17

제1절 국외 연구 현황 17

제2절 국내 연구 현황 19

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 21

제1절 근소포체 칼슘대사 구성인자 시스템의 확립 21

제2절 발굴된 칼슘대사 관련 유전자 모듈 및 네트워크의 조절 기전 분석 31

제3절 칼슘대사 관련 유전자 및 단백질 네트워크 간의 상관관계 규명 37

제4절 심장 질환 모델에서 신호전달계 모델링 동력학 분석 41

제5절 심장질환약물에 대한 칼슘대사 구성인자의 3차원적 반응 46

제6절 Knock-down 세포주를 이용한 칼슘 자극에 대한 반응 48

제7절 렌티바이러스 시스템의 확립 50

제8절 칼슘대사 모델을 통한 다양한 칼슘대사 네트워크의 특성연구 51

제9절 칼슘대사 관련 단백질의 정량 및 특성 연구 55

제10절 칼슘대사 관련 대사체의 메타볼로믹스 연구 60

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 64

제1절 연구개발의 최종목표 64

제2절 연차별 연구개발 목표 및 내용 65

제3절 계획대비 달성도 77

제4절 위 연구목표(총연구기간)에서 중요도 순으로 4-5개 목표 추출 및 가중치 부여 83

제5장 연구개발결과의 활용계획 84

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 86

제7장 참고문헌 88

근소포체의 칼슘대사와 심비대증의 시스템생물학연구 90

제출문 91

보고서 요약서 92

요약문 93

SUMMARY 96

CONTENTS 99

목차 100

제1장 연구개발과제의 개요 101

제1절 연구 개발의 목표 101

제2절 연구개발의 필요성 101

제3절 연구개발의 범위 102

제2장 국내외 기술개발 현황 103

제1절 국외 연구 현황 103

제2절 국내 연구 현황 105

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 107

제1절. 근소포체 칼슘대사 구성인자 시스템의 확립 107

1. 실시간 신호전달 단백질 활성 측정 107

2. RyR복합체의 EM 및 세포 미세구조 이미징 108

3. 세포 생리학적 칼슘 신호전달체계 연구 113

제2절. 발굴된 칼슘대사 관련 유전자 모듈 및 네트워크의 조절 기전 분석 117

1. 마우스 심근 신규 유전자의 기능 및 네트워크 특성 규명 117

2. 유전자 상호 작용 및 전사조절의 네트워크와 그 동력학적 특성 규명 120

3. 유전자 모듈 분석을 위한 알고리듬 개량 및 이종간 확대 분석 122

제3절. 칼슘대사 관련 유전자 및 단백질 네트워크 간의 상관관계 규명 123

1. 칼슘대사 이상 모델에서 유전자 발현 정보 분석 123

2. 칼슘대사 이상 모델에서 단백질 정량 분석 123

3. 칼슘대사 이상 모델에서 단백체 분석 및 전사체와 비교 124

4. 데이터 통합 및 분석 솔루션 개발 127

제4절. 심장 질환 모델에서 신호전달계 모델링 동력학 분석 128

1. 심근비대증에 주요한 신호전달체계 모델링 및 동역학 분석 128

2. 칼슘동역학을 하나의 통합된 시스템에서 분석할 수 있는 플랫폼 모델 개발 129

3. β-AR의 다중 부궤환 회로에 대한 동역학 및 기능을 분석 130

4. Calcineurin/NFAT 네트워크의 수학적 모델에 기반한 심근비대증의 기전 분석 131

5. Cardiac alternans (부정맥)의 발생 기전 탐구 131

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 133

제5장 연구개발결과의 활용계획 147

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 149

제7장 참고문헌 151

칼슘신호전달시스템의 시간적-공간적 바이오이미징 연구 153

제출문 154

보고서 요약서 155

요약문 156

SUMMARY 158

CONTENTS 159

목차 160

제1장 연구개발과제의 개요 161

제2장 국내외 기술개발 현황 162

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 164

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 182

제5장 연구개발결과의 활용계획 187

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 188

제7장 참고문헌 189

칼슘대사 관련 단백질 및 대사체의 시스템생물학 연구 191

제출문 192

보고서 요약서 193

요약문 194

SUMMARY 196

CONTENTS 198

제1장 연구개발과제의 개요 199

제2장 국내외 기술개발 현황 200

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 204

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 218

제5장 연구개발결과의 활용계획 222

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 222

제7장 참고문헌 223

I. 제목

칼슘대사시스템생물학 연구

II. 연구개발의 목적 및 필요성

최종목표: 근소포체 칼슘대사 네트워크의 규명과 칼슘대사 이상 심장 질환의 동력학 및 모델링 연구

3단계 연구개발 목표: 마우스 심근 세포 소포체의 칼슘대사 구성 인자 시스템의 특성을 규명하고 심장 질환 시 일어나는 분자 네트워크들의 조절 양상, 원인 및 효과를 서로 다른 층위에서 분석하여 미래형 치료제 개발을 위한 다양한 형태의 심장질환 모델들을 구축

연구개발의 필요성: 칼슘대사 시스템생물학 연구는 칼슘대사 이상에 의해 유발되는 심장 질환의 기전을 시스템 차원에서 이해하게 되어 부작용을 최소화하고 효율성을 극대화하는 약물 도출에 이바지할 것임

III. 연구개발의 내용 및 범위

⊙ 제 1 세부과제

▶ 근소포체에 존재하는 칼슘대사 구성 인자 시스템의 확립

- 실시간 신호전달 단백질 활성 측정

- RyR 복합체의 EM 및 세포 미세구조 이미징

- 세포 생리약리학적 칼슘 전달체계 연구

▶ 발굴된 칼슘대사 관련 유전자 모듈 및 네트워크의 조절 기전 분석

- 마우스 심근 신규유전자의 기능 및 네트워크 특성 규명

- 유전자 상호 작용 및 전사 조절 네트워크와 그 동력학적 특성을 규명

- 유전자 모듈 분석을 위한 알고리듬 개량 및 이종간 확대 분석

▶ 칼슘대사 관련 유전자 및 단백질 네트워크간의 상관 관계 규명

- 칼슘대사 이상 모델에서 유전자 발현 분석

- 칼슘대사 이상 모델에서 단백질 정량 분석

- 칼슘대사 이상 모델에서 단백질체와 전사체 분석 결과의 비교 분석

- 데이터 통합 및 분석 솔루션 개발

▶ 심장 질환 모델에서 신호전달계 모델링 및 동력학 분석

- 심근비대증에 주요한 신호전달체계 모델링 및 동역학 분석

- 칼슘동역학을 하나의 통합된 시스템에서 분석할 수 있는 플랫폼 모델 개발

- β-AR의 다중 부궤환 회로에 대한 동역학 및 기능을 분석

- β-AR 신호전달시스템에 대한 수학적 모델을 기반으로 심부전 발생 기전 분석

- Calcineurin/NFAT 네트워크의 수학적 모델에 기반한 심근비대증의 기전 분석

⊙ 제 2 세부과제

- 심근세포주에 18종의 형광표지된 칼슘대사 구성인자를 단독 또는 중복 도입시킨 후 발현양상을 영상을 통해 비교분석

- 10종 이상의 심장질환약물에 대한 칼슘대사 구성인자들의 3차원적인 반응 조사

- 생체 내 구성인자간의 3차원 이미지 디콘볼루션 및 시뮬레이션

- 선별한 4종의 C2C12 knock-down 세포주를 통해 구성인자들과 칼슘대사간의 관련성, 그리고 칼슘대사와 kinase의 활성간의 관계 규명

- C2C12 knock-down 세포주를 이용하여 근세포 분화에 칼슘대사 구성인자들이 미치는 영향에 대한 연구

- 위탁연구에서는 2단계 시스템생물학 연구사업 수행 중 심근세포 소포체의 칼슘대사 구성인자들을 대상으로 세포 수준에서 수행한 knock-down 실험에서 RNA 간섭에 의한 발현 제어가 확인된 유전자들의 functional genomic study를 동물모델(heart) 수준에서 수행하기 위해 RNAi용 렌티바이러스 유전자 발현 제어 기술을 이용한 knock-down mouse model 생산기술 구축

⊙ 제 3 세부과제

▶ 칼슘대사 네트워크의 고유 특성 연구 및 인자들 사이 연관성 연구

- 근소포체 관련 칼슘대사 단백질 및 대사체의 데이터베이스와 Drug - Target 데이터베이스 구축

- 연구 가능한 동역학적 전산 모형 및 네트워크 모형 제시

- ODE방정식을 통한 동역학 연구 및 FBA와 같은 정적인 네트워크 모델을 통한 칼슘대사 네트워크 연구

- 칼슘대사 네트워크 구성인자들 사이의 비선형적인 관계를 통한 흐름제어 연구

▶ 칼슘대사 주요 단백질의 정량 및 특성 연구

- 칼슘대사 관련 단백질의 정량화 연구

- 심근비대증 관련 단백질 및 신호전달 기전 분석

▶ 칼슘대사 관련 대사체의 메타볼로믹스 연구

- 칼슘대사 관련 대사산물의 미량분석을 위한 분석법 확립

- 대사체의 프로파일 분석에 의한 표지인자 발굴 연구

- 단백질 연구와의 연동성을 통한 대사 메카니즘 규명

IV. 연구개발결과

⊙ 제 1 세부과제

▶ 근소포체에 존재하는 칼슘대사 구성 인자 시스템의 확립

- 실시간으로 PKA 활성을 측정하는 construct 15종 디자인 중 5종을 확보하여 실시간 이미징에 성공함

- 전체 길이의 RyRl를 분리 정제한 뒤 EM 이미지를 획득하는 한편 pore형성 도메인의 EM 이미지 역시 분석하였음

- RyR 복합체 및 CLM, SERCA2, CSQ등의 RyR 상호작용 단백질들의 구조를 분석함

- 5종의 단백질이 RyR관련 네트워크에 상호작용함을 밝혔으며 이들의 칼슘의존성도 새롭게 규명하였음

- 칼슘대사 구성인자 7종의 발현 변이 모델에서 변화하는 칼슘대사의 생약리학적 변화를 규명하고 이를 기반으로 칼슘대사 신호전달을 모델링함

▶ 발굴된 칼슘대사 관련 유전자 모듈 및 네트워크의 조절 기전 분석

- 마우스 심근 신규유전자를 칼슘대사, 핵, 미토콘드리아 내 유전자 등 세 그룹으로 나누고 in silico적 방법을 통해 각각 2개, 5개, 8개의 타겟 유전자를 선정한 뒤 과발현 또는 knock-down 세포 모델을 확립함으로 각 신규유전자의 네트워크를 분석

- 칼슘대사 유전자 258개에 대한 네트워크를 작성하고 칼슘 변이에 따른 네트워크 동태를 분석하여 3종의 특정 전사인자에 의해 근소포체 내 스트레스 완충에 필요한 유전자 발현이 조절됨을 밝혀냄

- CSQ2 knock-down 모델의 전사체로부터 CSQ2가 NFkB 신호전달계를 조절함으로 근세포 분화를 조절함을 새롭게 밝혀냄

- 인간과 생쥐 심장 질환 개체의 전사체를 비교 분석함으로 유전자 네트워크를 작성하고 세포 사멸과 세포 외벽 관련 유전자 모듈이 인간과 생쥐 모두에서 심장질환 시 큰 발현 변화를 보임을 규명하였음

- 예쁜꼬마선충을 이용하여 칼슘대사 유전자인 annexin이 7종의 미토콘드리아 유전자와 기능적으로 상호작용함으로 심장박동 수를 현저히 저하시킴을 규명함

▶ 칼슘대사 관련 유전자 및 단백질 네트워크간의 상관 관계 규명

- 7종의 칼슘대사 이상 모델로부터 마이크로어레이를 통해 전사체를 확보하였음

- 칼슘대사 관련 유전자 5종의 발현을 변화시킨 동물 또는 세포 모델에서의 칼슘대사구성인자의 발현 변화를 측정한 결과 JTT 과발현 8주차 생쥐 심장에서 6종의 단백질 발현이 증감함을 새롭게 밝힘

- 칼슘대사 이상 모델 4종에 대해 단백질체를 확보하고 이를 비교 분석함으로 심장질환 관련성이 높은 8종의 단백질을 동정함

- 심장의 전사체, 단백체, 대사체, 상호작용체를 통합 비교하기 위한 분석 솔루션인 CIDMS를 개발하고 배포본을 제작하였음

▶ 심장 질환 모델에서 신호전달계 모델링 및 동력학 분석

- 심근비대증에 주요한 14개 신호전달체계를 총체적으로 정리하여 112개의 노드와 236개의 엣지로 이루어진 심근비대증 신호전달계를 작성한 뒤 해당 단백질들에 대한 전사체, 단백체, 대사체 데이터를 생산한 뒤 비교 분석함

- 작성된 심근비대증 신호전달계를 모델링하기 위해 Boolean 타입의 모델을 구현하였으며 유전자 발현 변화를 모델에 반영하기 위한 새로운 알고리즘을 개발함

- 칼슘동역학을 하나의 통합된 시스템에서 분석할 수 있는 약 120개 상미분 방정식으로 이루어진 플랫폼 모델 개발

- β-AR의 다중 부궤환 회로에 대한 동역학 및 기능을 분석하여 심부전 치료약물의 단일 및 복합치료에 따른 효능을 분석함

- Calcineurin/NFAT 네트워크의 수학적 모델에 기반한 심근비대증의 기전 분석함으로 nuclear NFAT가 ERK와 PI3K의 crosstalk을 통해 PI3K신호에 대해 biphasic 반응을 보인다는 사실을 밝힘

⊙ 제 2 세부과제

- 세포 내 칼슘의 저장고 역할을 하는 구성인자 CSQ2와 이와 결합하여 칼슘 분비를 조절하는 JNT과의 정량적 상관관계 확인함으로써 기존에 알려진 JNT의 역할에 새롭게 추가되는 기능 확인

- 위탁과제를 통해 PPI, PKA, PP2A gene에 대한 knock-down 세포주 (NIH/3T3)를 구축하였으며, VDAC2, CSQ2, SERCA2, IP3R gene에 대한 knock-down 세포주 (C2C12)를 구축하여 사업단 공동연구팀에게 제공

- 그 중 4종류 (CSQ2, PKA, IP3Rl, PPl)의 C2C12 knock-down 세포주에 β-Adrenergic receptor 자극 물질인 isoproterenol을 처리하여 각 구성인자의 결핍에 따른 kinase의 활성차이를 관찰

- 그 중 특히 C2C12 IP3 receptor type 1 knock-down 세포주의 경우 정상세포에 비해 isoproterenol에 대한 ERK의 활성이 증가하였고 myotube로 분화되지 않는 특성을 보였음.

- 또한 위탁과제를 통해 칼슘대사조절 유전자 네트워크 규명과 심근비대모델에서의 기능유전체학 연구에 필요한 knock-down 동물모델 제작 방법을 구축

⊙ 제 3 세부과제

▶ 칼슘대사 네트워크의 고유 특성 연구 및 인자들 사이 연관성 연구

- 칼슘대사 관련 심근세포의 에너지 대사에 관한 네트워크를 통해 에너지 대사 네트워크의 외부 자극에 대한 반응을 통계적으로 분석함.

- 칼슘대사 관련 에너지 대사의 네트워크 교란이 주어졌을 때, 네트워크의 반응 및 복구에 과정을 규명함.

▶ 칼슘대사 주요 단백질의 정량 및 특성 연구

- pH-mediated staking 방법을 이용하여 capillary electrophoresis의 분석 감도를 향상시키고 이 방법을 적용하여 세포내 존재하는 angiotensin을 측정함

- 심근세포인 HL-1세포에 isoproterenol과 endothelin-1으로 심근비대증을 유도하고 이때 차이나는 단백질과 신호 전달 과정을 규명함.

▶ 칼슘대사 관련 대사체의 메타볼로믹스 연구

- Physiological hypertrophy와 pathological hypertrophy를 유도한 mouse의 대사체의 프로파일링을 수행하고 특정 대사체에 대한 정량 연구를 수행하고 통계적 방법으로 분석함.

- 두 종류의 심근비대증에서 차이나는 것으로 확인된 대사체의 세포내에서의 작용기전을 규명함.

V. 연구개발결과의 활용계획

▶ 유전체 정보의 활용 계획

- 칼슘대사 이상 모델로부터 확보한 전사체 정보는 다양한 오믹스 데이터와의 비교 분석을 통해 칼슘대사시스템의 종합적인 이해의 바탕이 될 것임

- 3단계 연구에서 확보한 생쥐 심근 신규유전자 연구를 통해 다양하고 새로운 유전자 정보를 확보하였으며 이는 심근 시스템의 이해의 폭을 더욱 넓히는 효과를 가져올 것임

- 뉴질랜드 Hunter 교수 그룹에서 확립한 cardiome이 이후 고혈압 치료제 개발에 활용된 사례에서 볼 수 있듯이 3단계에서 확립된 다양한 전사체 정보는 이후 심장 질환 치료제 개발에 기초 자료로 활용될 수 있음

▶ 단백체 정보의 활용 계획

- RyR 복합체 EM 분석은 이후 생체기능 연구 및 칼슘대사 이상 질병의 진단 및 치료기술 개발의 기초자료로서 활용할 수 있음

▶ 모델링 및 동역학 기술의 활용 계획

- 칼슘대사시스템에 대한 수학적 모델링 및 비선형 동특성 분석은 궁극적으로 임상단계에서 심부전환자를 치료하기 위한 최적약물치료 전략을 개발하는데 활용될 수 있음

▶ 통합 웹 솔루션의 배포 및 활용 계획

- 다양한 층위에서 생산되는 대규모 데이터를 효율적으로 관리, 분석하기 위해 본 사업단에서 구축한 웹 솔루션인 CIDMS 데이터베이스는 고가 상용 프로그램인 Ingenuity Pathway Analysis (IPA), PathwayStudio등을 대체하는 한편, 보다 심장 맞춤형 컨텐츠를 제공함으로 전 세계 심장연구자들에게 높은 수준의 연구 환경을 제공할 것임

▶ 이미징 정보의 활용 계획

- 칼슘대사시스템을 구성하는 단백질들 간의 상호작용 데이터베이스를 구축하여 분자 수준에서의 칼슘대사기작을 규명하는 연구에 활용할 수 있는 기반을 제공

- 시간적 공간적 개념을 도입한 구성인자 (단백질) 상호작용 네트워크를 구축하여 새로운 신약표적 탐색 기반을 제공

- 외부 자극에 따른 상호작용의 변화나 질병 발생 및 전개에 따른 변화를 정보화하여 칼슘대사에 관련된 질환에 관한 여타 연구에 활용할 수 있는 기대효과가 있음

- 유전체, 단백체, 신호전달, 칼슘 imaging 등의 연구기법을 이용한 칼슘대사조절 유전자 네트워크 규명과 심근비대모델에서의 기능유전체학 연구에 필요한 동물모델을 제공함으로써, 칼슘대사-심근비대 모델을 확립하고 관련 질환의 예방 및 치료방법을 개발하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있음.