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보고서 초록
요약문
SUMMARY
CONTENTS
목차
제1장 연구개발과제의 개요 13
제1절 연구개발의 목적 13
제2절 연구개발의 필요성 13
제3절 연구개발의 범위 14
제2장 국내외 기술개발 현황 15
제1절 연구개발과제와 관련되는 국내외 현황 15
1. 저온 유도성 유전자의 분리 및 기능 15
2. C/DRE 매개 저온 유도성 유전자 발현조절 16
3. 유전학적 접근방식 16
4. 저온신호의 인지기구 19
5. 사이토키닌 호르몬 신호전달 경로 20
제2절 국내외 기술개발현황에서 차지하는 위치 21
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 24
제1절 1차년도 연구개발 수행 내용 및 결과 24
1. 연구범위 및 연구수행 방법 24
2. 연구수행 내용 및 결과 24
제2절 2차년도 연구개발 수행 내용 및 결과 25
1. 연구범위 및 연구수행 방법 25
2. 연구수행 내용 및 결과 26
제3절 3차년도 연구개발 수행 내용 및 결과 28
1. 연구범위 및 연구수행 방법 28
2. 연구수행 내용 및 결과 30
제4절 4차년도 연구개발 수행 내용 및 결과 32
1. 연구범위 및 연구수행 방법 32
2. 연구수행 내용 및 결과 33
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 35
제1절 1차년도 목표달성도 35
제2절 2차년도 목표달성도 36
제3절 3차년도 목표달성도 37
제4절 4차년도 목표달성도 38
제5절 관련분야에의 기여도 39
제5장 연구개발결과의 활용계획 41
제6장 참고문헌 42
[첨부] 48
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I. 제목
저온신호전달 구성성분 유전자 발굴 및 기능연구 와 cross-talk 규명
II. 연구개발의 목적 및 필요성
식물체는 저온, 건조, 고염 등의 환경 스트레스가 주어 졌을 때 이를 극복하기 위하여 유전자의 발현 조절을 포함한 많은 생리학적 발달학적 변화를 수반하며 대응하게 된다. 이러한 대응과정의 첫 단계인 스트레스 신호의 인지와 전달과정에 대한 이해는 이후 수반되는 유전자발현 조절과 스트레스 내성 및 극복 기구를 규명하고 이해하는데 필수적일 뿐만 아니라, 스트레스 내성 식물체의 제조에 중요한 기반을 제공하게 된다. 이와 같은 학술적, 응용적 측면에서의 중요성에도 불구하고 이 분야에 대한 연구는 세계적으로도 산발적이고 스트레스 신호를 인지하는 sensor에 관해서는 아직도 암중모색 단계이다. 그러나 최근 식물분자유전학 및 분자생물학의 발전에 힘입어 이에 대한 결과가 주요논문에 발표되고 있으며 이의 가속화가 예상된다. 현재까지는 저온 혹은 동결 등 낮은 온도에서 관여하는 유전자의 분리와 기능의 확인 등에 국한 되었다. 식물의 움직일 수 없는 고유한 특성 때문에 식물체의 외부 환경변화에 대한 반응은 호르몬, 빛, 대사 네트워크, 식물 성장 및 발달 등 시스템적으로 대응하여 적응하므로 식물의 외부 환경에 대한 반응 및 적응과정의 이해는 한 요인의 분석 보다는 이의 연결과 복합적 작용에 초점을 두고 접근해야한다. 스트레스 신호의 인지와 세포 내에서의 전달과정을 생화학적, 분자생물 및 분자 유전학적, 그리고 세포생물학 연구방법 등을 동원한 집중적이고 체계적이며 상호보완적인 연구가 필요하다.
본 연구 개발의 주목적은
식물체에서 주요 환경인자인 저온신호를 인지전달 하고 저온 유도성 유전자 발현에 이르기까지의 신호전달과정을 분자유전학, 분자생물학 및 세포 생물학적 방법으로 규명하고, 저온신호전달경로 단백질의 생화학적 작용기전을 밝힌다. 특히, 저온신호전달 구성성분의 개화시기 조절등과 같은 식물발달 및 식물호르몬 신호전달과의 cross-talk 및 다중기능 등을 규명한다. cytokinin 호르몬 신호전달과 two-component signaling (TCS) system를 통한 환경신호의 인지 전달과의 연계성을 규명하고 저온신호인지의 분자 작용모드를 확립한다.
III. 연구개발의 내용 및 범위
초기저온 발현 유전자중 애기장대 two-component system중의 하나인 ARR7을 중심으로 cytokinin receptors를 통한 신호전달경로와 저온을 포함한 여러 환경신호와의 연계성 규명을 완료하고, two-component system의 저온신호의 인지 메커니즘과 cytokinin signaling을 통한 식물세포성장 및 조절을 통한 환경적응 메커니즘을 규명한다. 환경신호 전달 및 호르몬 신호전달과의 네트워크에 의해 식물의 성장 발달조절을 통한 환경적응 메커니즘을 규명 한다. 저온 신호전달 경로를 규명하기 위하여 적용한 표적 유전학적 방법으로 분리한 저온 신호전달 돌연변이 애기장대인 acg1 (altered cold responsive gene expression)과 acg2, 그리고 역 유전학적 방법으로 분리한 two-component signaling system의 기능을 환경신호의 인지 전달 측면에서 생리학적, 생화학적, 분자유전학적, 분자생물학적 방법으로 분석하여 연구한다.
IV. 연구개발결과
주요 연구개발 결과는 아래와 같다.
역 유전학적 방법으로 저온 신호전달 경로와 신호 네트워크를 규명하고자 저온에 의해 초기에 mRNA의 축적이 유도되는 A-type ARR 유전자인 ARR7을 분리하여 저온 반응과 cytokinin 신호전달간의 crosstalk 및 two-component 시스템의 저온반응에서의 역할을 규명하고자 하였다.
ARR7은 cytokinin에 의한 발현 패턴처럼 초기에 발현이 시작되며 전이적인 발현 패턴을 보이며, ARR7 promoter-GUS 형질전환체도 저온 및 cytokinin에 의해 GUS staining 과 GUS 유전자 발현이 전이적으로 유도되어 전사 수준에서 cytokinin 및 저온에 의해 발현이 유도되는 유전자인 것으로 밝혀졌다.
ARR7과 발현 식물체의 분석 등 다양한 실험결과 ARR7은 다른 A-tyre ARR 유전자와 마찬가지로 cytokinin 반응 시 negative regulator로 작동하며, 수용 도메인의 인산화가 ARR7의 cytokinin 반응에서의 생물학적 생화학적 역할에 필수적 이라는 결과를 얻었다. ARR7뿐만 아니라 일부의 다른 A-type ARR 유전자들도 저온에 전이적으로 이른 시간대에 발현이 이루어졌다.
AHK2 와 AHK3이 중첩적으로 저온 인식과정에 관여하고 있으며 내재적인 cytokinin levels 과 무관하게 저온신호를 매개하는 것으로 나타났다. 저온은 A-type ARR 유전자 발현의 최대치를 보이는 4시간 안에 AHK2, AHK3 및 AHK4의 전사 양을 뚜렷하게 증가시키지 않았을 뿐만 아니라 cytokinin의 함량도 변화시키지 않았다. 저온이 cytokinin 함량 변화 없이 AHK2 및 AHK3 단백질을 통하여 A-type ARR 유전자의 발현을 유도하며 저온 반응에서 negative regulator로 작동함을 시사한다.
ARR7 과다 발현 식물체는 저온순화 후 동결 저항성 시험에서 대조 식물체에 비하여 감수성을 보였으며, arr5, arr6 및 arr7 기능상실 돌연변이체들은 저온 순화 전에 다소 증가된 동결저항성을, 저온순화 후에는 더 강한 동결저항성을 보였다. AHK2 및 AHK3과 저온 유도성 A-type ARR은 저온 신호전달경로에서 저온 순화과정과는 독립적으로 음성적 조절인자로 작용하고 있음을 보여주었다. ahk2 ahk3 이중 돌연변이체가 ABA 반응에서 감수성 반응을 보여주었으며 ABA 반응의 억제를 통하여 이루어지고 있는 가능성을 시사한다.
cytokinin 반응 과정은 동결저항성과 연계되어 있으며 아마도 외생적 cytokinin 처리에 의해 cytokinin 반응의 negative feedback 조절이 강화되어 동결저항성이 증가 된 것으로 나타났다. AHK-cytokinin 수용체의 저온인지 기전 규명을 안정적으로 수행하기 위하여 형질전환벡터인 Pro35s:FLAG:AHK3 및 자가인산화가 이루어지는 histidine 아미노산을 glutamine으로 바꾼 벡터도 제작하여 ahk3 및 ahk2 ahk3 돌연변이체에 형질전환식물체를 제작하였다.
AHK의 건조반응에서도 저온반응의 경우와 유사하게 음성적 조절인자로의 역할을 나타내었다.
애기장대 식물세포핵으로부터 GST 대조구 단백질에 비해 GST-FVE 단백질과 결합하는 세포핵 단백질을 분리하여 2-D gel 및 mass 분석 등으로 단백질을 동정 하였다. 아울러 FVE 과다발현식물체의 ChIP 분석을 수행하였다. 개화시기 돌연변이체와 이중돌연변이체를 molecular marker 및 개화시기 표현형을 이용하여 제작하여 경로 분석을 수행하였다.
자생식물이용기술개발사업단 사사 발표논문은 아래와 같다.
1. Jin Jeon, Nan Young Kim, Sunmi Kim, Na Young Kang, Ondrej Novak, Su-Jin Ku, Chuloh Cho, Dong Ju Lee, Eun-Jung Lee, Miroslav Strnad, and Jungmook Kim* (2010) A subset of cytokinin two-component signaling system plays a role in cold temperature stress response in Arabidopsis. Journal of Biological Chemistry in press. * Corresponding author
2. Han Woo Lee, Nan Young Kim, Dong Ju Lee, and Jungmook Kim* (2009) LBD18/ASL20 regulates lateral root formation in combination of LBD16/ASL18 downstream of ARF7 and ARF19. Plant Physiology 151 : 1377-1389. *Corresponding author.
3. Dong Ju Lee, Jong Wha Park, Han Woo Lee, and Jungmook Kim* (2009) Genome-wide analysis of the auxin-responsive transcriptome downstream of iaa1 and its expression analysis reveal the diversity and complexity of auxin-regulated gene expression. Journal of Experimental Botany 60: 3935-3957. *Corresponding author.
4. Su-Jin Ku, Jin-Young Park, Suk-Bong Ha, and Jungmook Kim* (2009) Overexpression of IAA1 with domain Ⅱ mutation impairs cell elongation and cell division in inflorescences and leaves of Arabidopsis. Journal of Plant Physiology 166: 548-553. *Corresponding author.
5. Jungmook Kim* (2008) Phosphorylation of A-Type ARR to function as negative regulator of cytokinin signal transduction. Plant Signaling and Behavior 3, 348-350. *Corresponding author
6. Lee, D.J., Kim, 5.-M., Ha, Y.-M., Park, J.-Y., and Jungmook Kim*. (2008) Phosphorylation of Arabidopsis response regulator 7 (ARR7) at the putative phosphor-accepting site is required for ARR7 to act as a negative regulator of cytokinin signaling. Planta 227: 577-587. *Corresponding author.
7. Jungmook Kim (2007) Perception, transduction, and networks in cold signaling. Journal of Plant Biology 50(2): 139-147. *Corresponding author.
8. Park, J.-E., Park, J.-Y., Kim, Y.-S., Staswick, P.E., Jeon, J., Yun, J., Kim, S,-Y., Jungmook Kim, Lee, Y.-H., and Park, C.-M. (2007) GH3-mediated auxin homeostasis links growth regulation with stress adaptation response in Arabidopsis. Journal of Biological Chemistry 282: 10036-10046.
9. Lee, D.J., Park, J.-Y., Ku, S.-J., Ha, Y.-M., Kim, S., Kim, M.D., Oh, M.-H., Jungmook Kim* (2007) Genome-wide expression profiling of ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR7 (ARR7) overexpression in cytokinin response. Molecular Genetics and Genomics 277: 115-137. *Corresponding author.
10. Chung, H.S., Ryu, M.Y., Park, M.J., Lee, M.M., Bahk, Y.-Y., Jungmook Kim, Pai, H.S., and Kim, W.T (2006) Heterologous expression and molecular and cellular characterization of CaPUB1 encoding a hot pepper U-box E3 ubiquitin ligase homolog. Plant Physiology 142: 1664-1682.
V. 연구개발결과의 활용계획
cytokinin 수용체의 기능상실 돌연변이체(ahk)의 동결저항성 및 건조저항성의 증진과 cytokinin 처리에 의한 단일 ahk 돌연변이체의 동결 및 건조 저항성 증진은 식물체의 환경저항성 증진을 위한 전략을 제시하고 있다. cytokinin 신호전달경로를 생장을 저해하지 않는 조건에서 적절히 억제한다면 환경저항성을 유도 할 수 있을 것으로 예측 된다. 이를 증명하기 위하여 cytokinin 신호전달경로를 억제하는 화학물질을 분리하고자 한다. 향후 산업적 응용의 가능성도 보여줄 것으로 기대된다.
지금까지의 연구결과들에 기초하여 AHK2 및 AHK3에 의해 조절되는 저온 반응성 하부 신호네트워크 transcriptome 분석을 수행하고, AHK2 및 AHK3의 저온 인지 기전을 규명한다. ARR7이 아닌 다른 저온 유도성 A-type ARR 유전자의 저온 반응에서의 기능을 다중 돌연변이체 및 기능획득 형질전환 식물체를 제작하여 확인한다. 아울러 AHP 및 B-type ARR의 저온 반응에서의 기능을 저온 유도성 A-type ARR 유전자를 포함한 AHK2 및 AHK3에 의해 조절되는 저온 반응성 하부 유전자들의 발현을 분석하여 규명한다. 이러한 연구는 애기장대 cytokinin two-component 신호전달 시스템의 저온 인지 및 전달 기전과 cytokinin 신호전달과의 연계를 분자수준에서 해석하여 식물의 외부 환경에 대한 반응 및 적응과정의 연결과 복합적 작용의 분자적 이해에 기여할 것이다. 아울러, LUC의 이용 및 저온과 사이토키닌 신호반응 조절 화학물질 신규 스크리닝 방법을 개발하여 식물발달 조절에 의한 동결 및 건조 저항성 유도 물질 개발을 지속적으로 시도한다.
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원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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