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Abstract
목차
제1장 서론 16
제1절 연구 개발의 중요성 및 필요성 16
1. 세포 및 유전자를 이용한 유해용량-반응 평가기술의 경제적·산업적 중요성 16
2. 세포 및 유전자를 이용한 유해용량-반응 평가기술 개발 연구의 필요성 16
3. 세포 및 유전자를 이용한 유해용량-반응 평가기술(생물지표측정법) 개발 현황 17
4. 세포 및 유전자를 이용한 유해용량-반응 평가기술의 국제적 활용 추세 17
제2절 연구개발의 국내외 현황 18
1. 세계적 수준 18
2. 국내수준 18
제3절 연구개발대상 기술의 차별성 20
1. 선진국대비 기술수준 분석 20
2. 본실험 연구기관의 연구현황 21
제2장 연구개발의 목표 및 내용 22
제1절 연구의 최종목표 22
제2절 연도별 연구개발의 목표 및 평가방법 22
제3절 연도별 추진체계 24
제3장 연구개발 결과 및 활용계획 26
제1절 연구개발 결과 및 토의 26
1. 다이옥신류 대체분석을 위한 바이오센서 분석기술의 표준화 27
2. 붕어종의 다이옥신 관련 유전자를 이용한 바이오센서 분석 기술 개발 71
3. 붕어종을 활용한 in vivo 다이옥신 독성평가 86
제2절 연구개발 결과 요약 127
제3절 연도별 연구개발목표의 달성도 134
1. 평가의 착안점 및 기준 134
2. 연구범위 및 연구수행 방법 136
3. 연도별 연구개발 목표의 달성도 137
제4절 연도별 연구성과(논문, 특허 등) 143
제5절 관련분야의 기술발전 기여도 144
1. 기술적인 측면 144
2. 환경적 측면 144
제6절 연구개발 결과의 활용계획 145
1. POPs 모니터링의 바이오평가기법으로 활용 145
2. 독성총량분석에 의해 POPs 물질군의 환경관리에 활용 145
3. 첨단 환경관리기술의 국내 도입 및 기술이전 145
4. 개발된 기술의 국제 인증 145
5. 환경모니터링 비용 절감 145
6. 바이오평가기법의 특허기술로서의 개발에 의한 경제성 추구 146
제4장 참고문헌 148
표 1. H4IIE-luc 세포주 기본 배양 조건 27
표 2. H4IIE-luc 유전자재조합세포 실험 방법 비교 28
표 3. 96웰플레이트에서 바깥쪽 웰과 안쪽 웰의 발광도 차이 유무 관찰 실험 결과 29
표 4. 시험웰의 반복성 측정 실험 결과(TCDD 4.7pM, DMSO 0.5%) 30
표 5. 시료 직접 주입법과 시료 사전희석 주입법 비교 및 시료운반용매(DMSO) 최대 사용량 결정을 위한 실험 결과 요약 33
표 6. 발광시약(루미솔)과 중단시약(스탑솔)을 사용했을 때의 자료 정밀도 평가 34
표 7. 다이옥신물질류 예상 반응 농도 범위 산정 36
표 8. 다이옥신물질류에 대한 CALUX SYSTEM용량-반응관계 규명 40
표 9. H4IIE-luc 유전자재조합세포의 LOD 및 LOQ에 대한 실험실내 및 실험실간 비교검증 44
표 10. H4IIE-luc 유전자재조합세포의 실험실내 및 실험실간 비교 검증; 2,3,7,8-TCDD EC50 산출 결과 46
표 11. H4IIE-luc 유전자재조합세포의 실험실내 및 실험실간 비교 검증; 2,3,7,8-TCDF 및 PCB77 물질의 TEF 산출 결과 47
표 12. 다이옥신물질류에 대한 H4IIE-luc 유전자재조합세포의 반응 상대 비교 48
표 13. H4IIE 세포주 기본 배양 조건 49
표 14. PAH류의 다이옥신 활성에 관한 정량적 평가 51
표 15. 다이옥신물질류 예상 반응 농도 범위 산정 54
표 16. EROD시험법에 사용하는 H4IIE세포의 LOD 및 LOQ에 대한 실험실내 및 실험실간 비교검증 55
표 17. 2,3,7,8-TCDD 표준독성물질에 대한 실험실내 및 실험실간 EC50 결과 비교 56
표 18. EROD 시험법의 실험실내 및 실험실간 시험 결과 비교; 2,3,7,8-TCDF 및 PCB77에 대한 TEF값 산출 결과 57
표 19. 다이옥신물질류에 대한 EROD 시험법의 반응 상대 비교 57
표 20. 환경시료에서 분석된 화학물질 종류 60
표 21. 분석결과 61
표 22. H4IIE-luc 유전자재조합세포시스템 및 기기분석에 의해 각각 산정된 Bio-TEQ와 I-TEQ값의 비교 분석 62
표 23. H4IIE EROD-microbioassay 및 기기분석에 의해 각각 산정된 Bio-TEQ와 I-TEQ값의 비교 분석 66
표 24. 세포양에 따른 Lipofectamine의 적정 사용량 76
표 25. 6caXRE-reporter gene assay의 LOD 및 LOQ 값의 실험실내 비교 검증 (ng/L) 80
표 26. 6caXRE-reporter gene assay의 실험실내 비교 검증; 2,3,7,8-TCDD EC50 산출 결과 82
표 27. 6caXRE-luc reporter gene assay의 실험실내 비교 검증; 2,3,7,8-TCDF 및 PCB77 물질의 TEF 산출 결과 83
표 28. 각 실험법간의 LOD 및 LOQ의 비교 (ng/L) 83
표 29. 다이옥신물질류에 대한 6caXRE-luc reporter gene 실험의 반응 상대 비교 84
표 30. 심장박동 발생율(heart beating) 및 박동율(heart rate) 110
그림 1. 노출 시간에 따른 TCDD EC50 변화 양상 31
그림 2. 발광시약 상용제품의 성능 비교 34
그림 3. CALUX SYSTEM에서의 Dioxins/Furans류 용량-반응 곡선 37
그림 4. CALUX SYSTEM에서의 Dioxin-like PCBs류 용량-반응 곡선 38
그림 5. CALUX SYSTEM에서의 Dioxin-like PCBs류 용량-반응 곡선 39
그림 6. 시험법 표준화 이전과 이후의 분석 자료 변이도 비교 42
그림 7. 각 기관별 LOD 및 LOQ 산출용 calibration curve 43
그림 8. CALUX SYSTEM의 2,3,7,8-TCDD 용량-반응 곡선 45
그림 9. EROD시험법에서의 2,3,7,8-TCDD 및 PAH류의 용량-반응곡선 51
그림 10. EROD 실험에서의 2,3,7,8-TCDD 표준독성물질의 용량-반응 평가 결과 56
그림 11. 고상폐기물 시료 중 다이옥신 및 퓨란 전처리 흐름도 60
그림 12. I-TEQ와 Bio-TEQ의 상관관계 (환경시료의 H4IIE-luc 유전자재조합세포실험: Lab A의 실험자 A) 63
그림 13. I-TEQ와 Bio-TEQ의 상관관계 (환경시료의 H4IIE-luc 유전자재조합세포실험: Lab A의 실험자 B) 64
그림 14. I-TEQ와 Bio-TEQ의 상관관계 (환경시료의 H4IIE-luc 유전자재조합세포실험: Lab B의 실험자 C) 64
그림 15. 환경시료의 H4IIE세포에서의 EROD활성 65
그림 16. I-TEQ와 Bio-TEQ의 상관관계 (환경시료의 H4IIE EROD-microbloassay: Lab A의 실험자 A) 67
그림 17. I-TEQ와 Bio-TEQ의 상관관계 (환경시료의 H4IIE EROD-microbioassay: Lab A의 실험자 B) 68
그림 18. I-TEQ와 Bio-TEQ의 상관관계 (환경시료의 H4IIE EROD-microbioassay: Lab B의 실험자 C) 68
그림 19. H4IIE-luc 유전자재조합세포시스템과 H4IIE EROD-microbioassay를 이용한 환경시료 Bio-TEQ 값의 상관관계 69
그림 20. pcDNA NA/V5/GW/D-TOPOR Vector로의 각 유전자 ligation 및 TnT system에 의한 단백 합성 결과(이미지참조) 72
그림 21. pGL4.17 basic vector를 이용한 6caXRE-luc construct합성 72
그림 22. 6caXRE-luc construct의 TCDD에 대한 반응성 확인(왼쪽) H4IIE-luc 유전자재조합세포에서의 TCDD에 대한 반응성(오른쪽) 73
그림 23. caAhRl-construct, caAhR2-construct 및 caARNT-construct의 TCDD에 의한 조절 74
그림 24. PLHC-1 세포에서의 2,3,7,8-TCDD에 대한 EROD 활성유도 74
그림 25. 6caXRE-reporter gene assay의 2,3,7,8-TCDD 용량-반응 곡선 77
그림 26. 6caXRE-reporter gene assay의 2,3,7,8-TCDD 용량-반응 곡선 81
그림 27. 6caXRE-reporter gene assay의 2,3,7,8-TCDD, 2,3,7,8-TCDF, PCB77 용량반응 곡선 82
그림 28. 2,3,7,8-TCDD에 96시간 동안 노출된 붕어의 생존율 89
그림 29. 붕어 아가미의 광학현미경사진. A: 새엽(Gf)과 새판(G1). H-E 이중염색. B: 새판 상피(Gle), 새판에 모세혈관(Bc)과 벽주세포(Pc). Masson's 삼중염색. C: 점액세포(Mc)와 염류세포(Chc). AB-PAS(pH 2.5) 반응. D: alcian blue양성의... 90
그림 30. 0.008㎍/L TCDD에 96시간 동안 노출된 붕어 아가미의 조직병리학적 변화. AB-PAS(pH 2.5) 반응. A: 모세혈관과 벽주세포의 신장, 새판의 상피박리. B: 새판의 괴사와 새엽 상피의 위축과 증생 91
그림 31. 0.008㎍/L TCDD에 96시간 동안 노출된 붕어 아가미의 미세구조. A와 B: 새판 상피세포의 변성 및 박리와 혈구 증생. C: 염세포의 변성. D: 모세혈관 융합과 식세포. E: 염세포 핵과 세포소기관의 변성. F: 점액세포의 변성 91
그림 32. 붕어 간의 광학현미경 사진. A: 췌장 (P)과 간세포 (H). H-E 이중염색. B: 담관 (Bd)과 간삭 (Hc). AB-PAS (pH 2.5) 반응 92
그림 33. TCDD에 96시간 동안 노출된 붕어 간의 조직병리학적 변화. A: 0.008 ㎍/L에 노출된 간세포의 비대 및 세포질 변성 92
그림 34. 0.008㎍/L TCDD에 96시간 동안 노출된 붕어 간의 미세구조. A: 미토콘드리아의 초기변성. B: 미토콘드리아의 붕괴와 초기 세포질 균질화. C: 세포소기관의 붕괴와 세포질 공포화. D: 핵 응축과 세포질 균질화 93
그림 35. 붕어 신장의 광학현미경사진. A: 두신. H-E 이중염색. B: 체신의 사구체(G)와 세뇨관 (Rt). H-E 이중염색. C: 체신의 사구체 (G)와 세뇨관 (Rt). Masson's 삼중염색. D: 체신의 사구체 (G)와 세뇨간 (Rt). AB-PAS (pH 2.5) 반응 94
그림 36. 0.004㎍/L TCDD에 96시간 동안 노출된 붕어 신장의 조직병리학적 변화. AB-PAS (pH 2.5) 반응. A: 사구체 변성과 세뇨관 내강의 폐쇄. B: 간질세포 핵응축 및 보우먼주머니의 붕괴 94
그림 37. 0.002㎍/L TCDD에 96시간 동안 노출된 붕어 신장의 미세구조. A와 B: 세뇨관 상피세포의 세포소기관 초기 변성과 혈구 증가. C: 세뇨관 내강의 폐쇄 및 상피세포 연접의 붕괴. D: 보우먼주머니와 사구체의 초기 변성. D와 F: 보우만주... 95
그림 38. TCDD 96시간 노출 후 12주간 회복 실험한 붕어의 사망률 95
그림 39. TCDD 96시간 노출 후 회복실험한 붕어의 성장 96
그림 40. TCDD에 96시간 노출 후 12주간 회복 실험한 붕어의 GSI 97
그림 41. TCDD에 96시간 노출 후 12주간 회복 실험한 붕어의 HSI 98
그림 42. TCDD에 96시간 노출 후 12주간 회복 실험한 붕어의 이성세포 출현율 99
그림 43. TCDD에 96시간 노출 후 12주간 회복 실험한 붕어의 아가미의 조직병리학적 변화 A: 새엽 상피의 증생과 비대. 0.002㎍/L. H-E 이중염색. B와 C: 새판 상피층의 박리. 0.004㎍/L. AB-PAS (pH 2.5)... 100
그림 44. TCDD에 96시간 노출 후 12주간 회복 실험한 붕어 간의 조직병리학적 변화. A: 간세포 핵의 비대. 0.004㎍/L. AB-PAS(pH 2.5) 반응. C와 D: 간세포... 100
그림 45. TCDD에 96시간 노출 후 12주간 회복 실험한 붕어 신장의 조직병리학적 변화 A: 세뇨관 상피세포의 부종. 0.002㎍/L. H-E 이중염색. B와 C: 0.004㎍/L. 사구체의 팽창 및 변성. D와 E: 혈구의 침적과... 101
그림 46. TCDD 급성노출과 회복기간 후 CYP1A 발현확인 102
그림 47. 수컷붕어의 특징(왼쪽: 금붕어, 오른쪽: 야생붕어; 흰색돌기: Small white breeding tubercles) 103
그림 48. 금붕어 암수 합사 후 난 생산, 산란 및 수정 과정 104
그림 49. 비노출 붕어의 시간별 난 발달 과정 104
그림 50. 자연수정 및 인공수정된 야생붕어 난의 발달과정 105
그림 51. 붕어 수정란의 TCDD노출(0.5㎍/L)에 따른 발달 단계 독성 →: york sac edema; →: pericardial edema 107
그림 52. 붕어 수정란의 TCDD노출에 따른 AhR1, AhR2 및 CYP1A발현 확인 108
그림 53. 수정란의 TCDD노출 설계 및 배양 시간별 관찰 마커 109
그림 54. 부화율(%), 75 hpf 110
그림 55. Pericardial edema(%), 75 hpf 111
그림 56. Morphological change, 75 hpf 111
그림 57. 부화 후 붕어(Carassius auratus) 자어의 형태. A: Con(비노출군)(×25), B: 0.1% Toluene(×25), C: 0.1% Toluene(×90), Con(비노출군)(×50), E, eye; Mp (Melanophore, 흑색소포); Y (York sac, 난황) 112
그림 58. TCDD 노출 난의 부화 후 붕어(Carassius auratus) 자어의 형태. A: 0.039㎍/L(×30), B: 0.039㎍/L(×30), C: 0.039㎍/L(×40), D: 0.156㎍/L(×32), E: 0.156㎍/L(×63) F: 00.156㎍/L(×50), Y, York sac(난황) 112
그림 59. 노출 난의 부화 후 붕어(Carassius auratus) 자어의 형태. A: 0.625㎍/L (×30), B: 0.625㎍/L(×50), C: 2.5㎍/L(×40), D: 2.5㎍/L(×50), E: 2.5㎍/L(×50), F: 10 ㎍/L(×46); Mp (Melanophore, 흑색소포); Y (York sac, 난황) 113
그림 60. TCDD노출 붕어수정란의 부화 후 자어의 난황낭 크기 Con: 0.1% Toluene; Significantly different from control 114
그림 61. TCDD노출된 붕어수정란의 부화 후 자어의 흑색소포분포비율 Con: 0.1% Toluene; Significantly different from control 114
그림 62. TCDD노출된 붕어수정란의 부화 후 자어의 피부계. AB-PAS(pH 2.5) 반응. A: Con, B: 0.039㎍/L, C: 0.156㎍/L, D: 0.156㎍/L, E: 0.625㎍/L, open asterisk, alcian blue positive; black asterisk, alcian blue negative, F: 2.5㎍/L, G: 2.5㎍/L,... 116
그림 63. TCDD노출된 붕어수정란의 부화 후 자어의 주사전자현미경 사진. A: 0.1% toluene (V-C), B: 0.1% toluene(V-C), C: Con; Dmf(등쪽 막지느러미); E(눈); M(체절); Mf(막지느러미);... 118
그림 64. TCDD노출된 붕어수정란의 부화 후 자어의 주사전자현미경 사진. A: 0.1% toluene(V-C), B: 0.1%... 118
그림 65. TCDD노출된 붕어수정란의 부화 후 자어의 주사전자현미경 사진. A: 0.039㎍/L, B: 0.039㎍/L, C: 0.039㎍/L, D: 0.156㎍/L;... 119
그림 66. TCDD노출된 붕어수정란의 부화 후 자어의 주사전자현미경 사진. A; 0.156㎍/L, B: 0.625㎍/L, asterisk, atrophy of... 119
그림 67. TCDD노출된 붕어수정란의 부화 후 자어의 주사전자현미경 사진. A: 2.5㎍/L, arrowhead, mucous cell, B: 2.5㎍/L, C: 2.5㎍/L, arrowhead, head collapse; E(눈);... 119
그림 68. TCDD 노출된 붕어 수정란의 AhR1 및 AhR2 발현 확인 120
그림 69. TCDD 노출된 붕어 수정란의 CYP1A 발현 확인 120
그림 70. 수정란의 TCDD노출 설계 및 배양 시간별 관찰 마커 121
그림 71. 부화율(%), 78 hpf 122
그림 72. hemorrhage (%) 122
그림 73. 치사율(%), 150 hpf 123
그림 74. Pericardial Edema(%) 124
그림 75. York sac Edema(%) 124
그림 76. TCDD 노출된 붕어 수정란의 CYP1A 발현 확인 125
그림 77. 국제대체독성시험법 인증절차(ICCVAM) 130
그림 78. 대체독성시험법 인증 절차의 흐름도 131
그림 79. 대체독성시험법 전문시험기관 인증 및 시험제도의 흐름도 131
그림 80. 대체독성시험법의 다이옥신 분석비 절감효과 132
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