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표제지
용역연구사업 연구결과보고서
제출문
목차
I. 연구결과보고서 요약문 5
한글 : 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스분리를 위한 세포주 개발 5
영문 : Development of porcine cell lines for isolating European PRRS virus. 6
II. 총괄연구개발과제 연구결과 7
제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 7
1.1. 총괄연구개발과제의 목표 7
1.2. 총괄연구개발과제의 목표달성도 11
1.3. 국내·외 기술개발 현황 12
제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 13
2.1. 연구내용 13
2.2. 연구방법 13
제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 16
가. PRRS 바이러스 세포 수용체 유전자 porcine CD163 클로닝 16
나. 돼지폐포대식세포주(ATCC CRL-2843)의 CD163 발현 여부 확인 16
다. PRRS 바이러스 세포 수용체 CD163 발현 돼지폐포대식세포주 작성 및 특성 연구 18
라. CD163 발현 돼지폐포대식세포주를 활용한 PRRS 바이러스 감수성 및 증식율 테스트 20
마. 초대배양세포 불멸화 유도 시스템 구축 22
바. 초대배양 돼지 폐포대식세포 유래 불멸화 세포주 제작 23
마. 불멸화 PAM-KNU 세포주의 CD163 발현 여부 확인 25
사. 형질전환 불멸화 PAM-KNU 세포주의 PRRS 바이러스 감수성 테스트 26
제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 30
제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 32
5.1. 활용성과 32
5.2. 활용계획 33
제6장 기타 중요변경사항 34
제7장 참고문헌 35
제8장 첨부서류 37
III. 제○세부연구개발과제 연구결과 45
제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 46
1.1. 세부연구개발과제의 목표 46
1.2. 세부연구개발과제의 목표달성도 46
1.3. 국내·외 기술개발 현황 46
제2장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 46
제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 46
제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 46
제5장 세부연구개발과제의 연구성과 46
5.1. 활용성과 46
5.2. 활용계획 47
제6장 기타 중요변경사항 47
제7장 참고문헌 47
제8장 첨부서류 47
본문작성 요령 48
총괄 연구과제 요약 49
세부 연구과제 요약 52
초록보기 더보기
본 연구과제에서는 국내 돼지의 소모성질환을 유발하는 주요 원인체인 PRRS 바이러스에 감수성을 보유하는 돼지 유래 폐포대식세포주를 구축하고 이를 활용하여 국내에 유행하고 있는 바이러스의 분리 동정 및 유전자적 특성 규명을 목표로 하였다. 먼저 성공적인 PRRS 바이러스 부착과 cell tropism에 필수적인 역할을 담당하는 바이러스 세포 수용체인 돼지 CD163(pCD163)을 클로닝을 먼저 실시하였고 이를 과발현하는 돼지 유래 폐포대식세포주(PAM-pCD163)를 구축하였다. 작성된 세포주를 이용하여 단백질 발현 정도 및 성장률등의 세포주 특성을 연구하였고 pCD163 발현율이 높은 세포주를 선택하여 바이러스 감수성 및 증식율을 원숭이 유래 PRRS 바이러스 감수성 세포인 Marc-145 세포와 비교하였다. 그 결과 PAM-pCD163 세포주는 type 1(유럽형) 및 type 2(북미형) PRRS 바이러스들에 감수성을 보이며 Marc-145 세포주에서보다 높은 역가의 바이러스 증식율을 보여주었다. 또한 이와 더불어 simian virus 40 large T 항원(SV40-LT) 또는 human telomerase reverse transcriptase(hTERT) 유전자의 도입을 통하여 초대배양세포의 불멸화를 유도할 수 있는 시스템을 구축하였다. 이 구축된 시스템을 이용하여 초대배양 돼지 폐포대식세포에 유전자 조작 및 세포클로닝을 통한 불멸화를 유도하여 돼지 유래 폐포대식세포주를 구축 하였고 각각 세포 클론들의 특성을 조사하였다. 작성된 돼지폐포대식세포주(PAM-KNU)들을 이용하여 바이러스 감수성과 증식율을 기존 PAM-pCD163과 비교 분석하여 PRRS 바이러스에 가장 감수성이 높은 세포클론 선발하였다. 전반적으로 불멸화 PAM-KNU 세포주는 세포 수용체 발현 PAM-pCD163 세포주보다 유사한 또한 향상된 바이러스 감수성을 보여주었다. 마지막으로 선발된 PAM-KNU 세포주를 이용하여 야외가검물에서 유럽형 PRRS 바이러스를 분리를 실시하였고 국내에서 유행하고 있는 야외 바이러스 분리주들에 대한 유전학적 특성을 확인하였다. 본 연구를 통해 구축되어진 돼지 유래 PAM-pCD163 및 PAM-KNU 세포주들을 이용하면 기존 시스템보다 용이하게 유럽형 및 북미형 야외 바이러스 분리가 가능할 것으로 사료되며 또한 분리된 바이러스의 유전자적 분석을 통해 국내에서 유행하고 있는 PRRS 바이러스 특성을 광범위하게 규명될 수 있을 것으로 판단된다.
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