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제출문

보고서 초록

목차

제1장 서론 18

제1절 연구개발의 중요성 및 필요성 20

1. 연구개발의 필요성 및 동향 20

2. 연구개발의 국내·외 현황 28

3. 연구개발대상 기술의 차별성 33

제2장 연구개발의 목표 및 내용 36

제1절 연구개발의 최종목표 38

1. 표적 별 갑상선호르몬 장애물질 검색을 위한 세포주 시스템 확립 38

2. 독성유전체 기술을 활용한 갑상선호르몬 장애물질의 유전자 분자 지표 발굴 38

3. 스테로이드생합성과 글루코오스신생합성 관련 유전자 발현조절에 대한 갑상선호르몬 장애물질의 영향 기전 규명 38

4. 차세대 지표를 이용한 갑상선호르몬 장애물질 검색 방법의 구축 및 활용 39

제2절 연도별 연구개발의 목표 및 평가방법 40

1. 연도별 연구개발의 목표 및 내용 40

2. 연도별 연구개발의 평가방법 42

제3절 연도별 추진체계 44

제3장 연구개발 결과 및 활용계획 46

제1절 연구개발 결과 및 토의 48

1. 표적별 갑상선호르몬 장애물질 검색을 위한 세포주 시스템 확립(주관기관 & 위탁기관) 48

가. 갑상선 과산화효소를 표적으로 하는 인간 갑상선 소포암 세포주 FTC-238을 이용한 in vitro assay 시스템 확립 및 환경유해화학물질 영향 조사(주관기관) 48

나. 탈요오드화효소를 표적으로 하는 인간 신경 세포주를 이용한 in vitro assay 시스템 확립 및 환경유해화학물질 영향 조사(주관기관) 66

다. TR을 표적으로 하는 정소의 라이디히 세포와 간세포을 이용한 in vitro assay 시스템 확립 및 환경유해화학물질 영향 조사(위탁기관) 78

2. 독성유전체 기술을 활용한 갑상선호르몬 장애물질의 유전자 분자 지표 발굴 (주관기관) 85

가. FTC-238／hrTPO 세포주에서 갑상선 과산화효소(TPO)를 표적으로 하는 갑상선호르몬 장애물질에 의한 유전자 발현 프로파일 확보 및 비교연구(주관기관) 85

나. 인간 신경세포주에서 탈요오드화효소(deiodinase)를 표적으로 하는 환경 유해 화학물질에 대한 표적 유전자의 발굴 및 분자지표 검증 연구(주관기관) 111

3. 스테로이드생합성(steroidogenesis)과 글루코오스신생합성(gluconeogenesis) 관련 유전자 발현조절에 대한 갑상선호르몬 장애물질의 영향 기전 규명(위탁기관) 128

가. 정소 라이디히 세포(testis Leydig cell)에서 스테로이드생합성 (steroidogenesis) 조절 관련 유전자 발현에 대한 TR 작용 장애물질의 영향 분석(위탁기관) 128

나. 간세포의 당, 지질대사 조절 관련 유전자 발현에 대한 TR 작용 장애물질의 영향 분석 (위탁기관) 138

4. 차세대 지표를 이용한 갑상선호르몬 장애물질 검색 방법의 구축 및 활용 (주관기관) 143

가. 발굴된 유전자 지표를 활용한 유전자 기반(gene-based) 갑상선호르몬 장애물질 검색 방법 확립 및 시제품 개발(주관기관) 144

나. 표적(target)별 갑상선호르몬 장애 추정물질들에 대한 적용을 통한 민감도(sensitivity)와 특이성(specificity) 검증 연구(주관기관) 146

제2절 연구개발 결과(요약) 및 결론(제언) 149

제3절 연도별 연구개발목표의 달성도 153

제4절 연도별 연구성과 (논문·특허 등) 156

제5절 관련분야의 기술발전 기여도 160

제6절 연구개발 결과의 활용계획 161

제4장 참고문헌 162

부록 : 환경유해화학물질 중 갑상선호르몬 장애물질 검색을 위한 in vitro 시스템 시험법 매뉴얼 167

1장 본 매뉴얼의 목적 177

2장 본 매뉴얼의 개요도 181

3장 실험 방법 185

1절 갑상선호르몬 표적별 세포주 시스템 확립 185

가. 갑상선 과산화효소(Thyroid peroxidase, TPO) 185

나. 탈요오드화효소(Deiodinase) 192

다. 스테로이드생합성(Steroidogenesis) 204

라. 글루코오스신생합성(Gluconeogenesis) 206

2절 환경유해화학물질의 갑상선호르몬 표적별 영향 분석 208

가. 갑상선 과산화효소(Thyroid peroxidase) 208

나. 스테로이드생합성(Steroidogenesis) 210

다. 글루코오스신생합성(Gluconeogenesis) 215

3절 마이크로어레이 분석: 유전자 발현 프로파일 확보 연구 217

가. 갑상선 과산화효소(Thyroid peroxidase) 217

〈실시예 1〉 적정 농도 선정 217

〈실시예 2〉 전체 RNA 분리 방법 218

〈실시예 3〉 target RNA 증목 및 DNA 합성 219

〈실시예 4〉 Microarray Hybridization & Scanning 219

〈실시예 5〉 Microarray Data Analysis 221

나. 탈요오드화효소(Deiodinase) 222

〈실시예 1〉 전체 RNA 분리방법 222

〈실시예 2〉 Target RNA 증목 및 DNA 합성 222

〈실시예 3〉 Microarray Hybridization & Scanning 222

〈실시예 4〉 Microarray Data Analysis 223

다. 유전자발현 프로파일의 비교 분석 224

4절 갑상선호르몬 장애를 판별할 수 있는 표적 특이적 유전자 지표 탐색 및 발굴 226

가. 갑상선 과산화효소(Thyroid peroxidase) 226

나. 탈요오드화효소(Deiodinase) 232

다. 스테로이드생합성(Steroidogenesis) 234

라. 글루코오스신생합성(Gluconeogenesis) 238

5절 갑상선호르몬 Target 특이적 유전자 지표들이 집적된 CTT Array 제작의 예 240

4장 Appendix(용어 정리) 243

〈표 1〉 WWF에서 지정한 내분비계 장애물질 목록 중 갑상선호르몬계에 영향을 주는 화학 물질 목록(본 연구팀에서 조사한 자료) 23

〈표 2〉 Thyroid hormone disruptor로 추정되는 물질들의 제조량, 수입량, 사용량 24

〈표 3〉 EDSTAC에서 제시하는 내분비계 장애물질 1단계 검색법 25

〈표 4〉 갑상선호르몬 합성에서의 disruption points와 disruption 물질 27

〈표 5〉 과이어콜 어세이(guaiacol assay)에 이용되는 각각의 용액 54

〈표 6〉 DIO1, DIO2, DIO3 프라이머 서열 70

〈표 7〉 3종의 Deiodinase의 처리 순서 72

〈표 8〉 혼성화 완충용액(Hybridization buffer)의 조성 88

〈표 9〉 4종의 갑상선호르몬 장애물질의 TPO 활성 농도 및 non-toxic 농도 90

〈표 10〉 TPO 활성 특이적 362종 유전자의 TPO 활성 물질별 예측 99

〈표 11〉 TPO 활성 특이적 362종의 클래시파이어(classifier) 100

〈표 12〉 프라이머 서열 115

〈표 13〉 대표적 deiodinase 특이적 유전자 지표 117

〈표 14〉 Deiodinase-Knockdown SH-SY5Y Cells에서의 유전자 온톨로지(Gene Ontology) 분석 120

〈표 15〉 본 연구에 사용된 화학물질 123

〈표 16〉 Deiodinase 장애(disruption) 관련 유전자 지표 검증 127

〈표 17〉 검증시료의 실험 조건 146

표 3-1-1. TPO 활성 측정을 위한 조성 191

표 3-1-2. 전체 RNA 분리 방법 194

표 3-1-3. 실시간 정량 PCR(Quantitative real time RT-PCR) 방법 201

표 3-1-4. DIO1, DIO2, DIO3 primer sequences 204

표 3-2-1. 화학물질에 반응시킨 TPO extraction을 이용한 guaiacol assay를 위한 조성 208

표 3-4-1. Deiodinase disrupting chemical에 의한 deiodinase disruption 특이적 유전자지표의 발현 변화 확인 예시 233

〈그림 1〉 우리나라 암발생 부위별 등록건수 추이 및 표준화 발생비 분석(여자) 20

〈그림 2〉 갑상선호르몬의 합성, 분비 및 작용 21

〈그림 3〉 독성유전체학의 개념도 26

〈그림 4〉 갑상선호르몬 합성에 있어서 갑상선 과산화효소(TPO)와 탈요오드화효소(deiodinase)의 작용점 49

〈그림 5〉 FTC-238/hrTPO 세포주 구축 50

〈그림 6〉 갑상선 과산화효소 추출 과정 53

〈그림 7〉 벤조페논-2(benzophenone-2), 메티마졸(methimazole), 제니스테인 (genistein)의 화학 구조 54

〈그림 8〉 Benzophenones류, PAHs류, POPs류 등의 화학물질 구조 I 55

〈그림 9〉 기타 화학물질 구조 56

〈그림 10〉 Human TPO cDNA plasmid의 제한효소 분절에 의한 결과물 확인 57

〈그림 11〉 후보 FTC-238/hrTPO 세포주의 갑상선 과산화효소(TPO) 활성 측정 59

〈그림 12〉 양성대조군(positive control)에 의한 갑상선 과산화효소 활성 측정(Methimazole, 메티마졸; Genistein, 제니스테인; 2,2, '4,4' -tetrahydroxybenzophenone, 벤조페논-2) 60

〈그림 13〉 Benzophenones 류의 갑상선 과산화효소 활성 측정 61

〈그림 14〉 PAHs 류의 갑상선 과산화효소 활성 측정 62

〈그림 15〉 POPs 류의 갑상선 과산화효소 활성 측정 63

〈그림 16〉 기타 갑상선호르몬 장애물질의 갑상선 과산화효소 활성 측정(DBP, di-n-butyl phthalate) 64

〈그림 17〉 siRNA의 원리 67

〈그림 18〉 실시간 정량 PCR(real time RT-PCR)과정 69

〈그림 19〉 실시간 정량 PCR(real time RT-PCR)의 정량 원리 70

〈그림 20〉 SH-SY5Y 세포주에서의 Deiodinase 3종의 유전자 발현 확인 73

〈그림 21〉 3종의 Deiodinase siRNA의 후보 siRNA들의 knockdown 효율 74

〈그림 22〉 Deiodinase siRNA에 의한 deiodinase type별 mRNA 발현 수준 확인 75

〈그림 23〉 Deiodinase siRNA 처리 순서에 따른 deiodinase type별 mRNA level 확인 76

〈그림 24〉 T3 농도 측정 77

〈그림 25〉 환경 유해물질의 구조와 Surflex-Dock program을 사용한 환경 유해물질의 TR 결합 능력 예측 79

〈그림 26〉 TRE에 작용하는 TR에 대한 환경유해물질의 영향 80

〈그림 27〉 AML-12 mouse hepatoma cell line에서 T3에 의한 TRE 활성도 81

〈그림 28〉 AML-12 마우스 간암세포주(mouse hepatoma cell line)에서의 갑상선호르몬 의한 TR 전사활성 (transcriptional activity) 측정 83

〈그림 29〉 HepG2 세포에서 T3RE 활성도에 대한 다양한 유해물질의 영향 84

〈그림 30〉 4종의 갑상선호르몬 장애물질의 세포독성 결과 (BP-2, 2,2', 4,4'-tetrahydroxybenzophenone; DBP, di-n-butyl phthalate) 89

〈그림 31〉 FTC-238 세포주에서 벤조페논-2(BP-2), 디부틸프탈레이트(DBP), 카바릴(carbaryl), 빈클로졸린(vinclozolin)의 유전자 발현 양상 92

〈그림 32〉 FTC-238/hrTPO/RSK008 세포주에서 벤조페논-2(BP-2), 디부틸프탈레이트(DBP), 카바릴 (carbaryl), 빈클로졸린(vinclozolin)의 유전자 발현 양상 93

〈그림 33〉 TPO 활성 특이적 마커 유전자 발굴을 위한 데이터 분석 방법 전략 94

〈그림 34〉 TPO 활성 특이적 유전자 분자 지표 발굴을 위한 분석방법 및 결과 96

〈그림 35〉 TPO 활성 특이적 362종 유전자의 클러스터링(clustering) 분석 98

〈그림 36〉 TPO 활성 특이적 362종 유전자의 PCA 분석 99

〈그림 37〉 추가물질을 이용한 362종의 유전자 분자 지표의 검증 (MM, Methylmercury; B(a)P, Benzo(a)pyrene; Car, Carbaryl; D(a,h) A, Dibenzo(a,h)anthracene; DBP, Di-n-butyl phthalate; MMI,Methimazole; BABDE,... 110

〈그림 38〉 SH-SY5Y/DKD 세포주와 T3처리 SH-SY5Y의 유전자 발현 양상 비교 114

〈그림 39〉 Deiodinase 특이 유전자 검증 122

〈그림 40〉 6종의 화학물질의 세포독성 결과 (Methimazole, MMI; 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD; Polychlorinated Biphenyls, PCB;Iodoacetic acid. IAA; Propylthiouracil, PTU; Methylmercury, MM) 125

〈그림 41〉 Yeast two-hybrid system 원리 128

〈그림 42〉 Nur77 전이활성(transactivation) 기능에 TRα/T3가 미치는 영향 129

〈그림 43〉 TRE-luc reporter의 T3 농도 의존적 발현 유도 130

〈그림 44〉 라이디히 세포(Leydig cell)에서 환경유해물질이 TR에 의한 Nur77 전사기능 조절에 미치는 영향 131

〈그림 45〉 Steroidogeic enzyme promoter-luc의 환경유해물질에 의한 활성 변화 132

〈그림 46〉 환경유해물질 벤조페논-2(BP2), 카바릴(cabaryl)에 의한 steroiogenic enzyme gene mRNA 발현 변화 133

〈그림 47〉 환경유해물질에 의한 스테로이드 합성 관련 효소(steroiogenic enzyme) 발현 변화 134

〈그림 48〉 환경유해물질에 의한 남성호르몬 생성 변화 135

〈그림 49〉 in vivo에서 벤조페논-2(BP2)에 의한 남성호르몬 생성변화 136

〈그림 50〉 마우스 정소에서 벤조페논-2(BP2)에 의한 스테로이드 호르몬 합성 관련 효소 유전자(steroidogenic enzyme gene) 발현 변화 137

〈그림 51〉 HepG2 세포에서 갑상선호르몬에 의한 ChREBP와 CYP7A1 전사 활성도 및 발현에 대한 유해물질 영향 139

〈그림 52〉 HepG2 세포에서 갑상선호르몬에 의한 CYP7A1 전사 활성도 및 발현에 대한 유해물질 영향 140

〈그림 53〉 HepG2 세포에서 갑상선호르몬에 의한 CYP7A1 발현에 대한 유해물질 영향 141

〈그림 54〉 HepG2 인간 간암세포주에서의 TR 결합단백질(interacting protein)에 의한 TR/TRE-luc의 활성에 대한 환경유해물질 작용 메커니즘 142

〈그림 55〉 Chemical Thyroid Target(CTT)-Array Ver. 1.0의 모식도 145

〈그림 56〉 Chemical Thyroid Target(CTT)-Array Ver. 1.0의 실제 이미지 145

〈그림 57〉 CTT-Array Ver. 1.0의 갑상선호르몬 표적별 검증 (BP2, 2,2', 4,4,'-tetrahydroxybenzophenone;Di-n-butyl phthalate, DBP; Carbaryl, Car; Genestein, Gen; Iodoacetic Acid, IAA;) 148

그림 2-1-1. 갑상선호르몬 target 특이적 유전자 지표 발굴 과정 및 CTT Array를 이용한 환경유해화학물질 중 갑상선 호르몬 장애물질 검색 시스템의 프레임워크 개요도 181

그림 3-1-1. FTC-238 세포주의 형태 186

그림 3-1-2. Heat shock 모식도 186

그림 3-1-3. Transformation 된 수용세포의 LB agar plate에의 spreading 모식도 187

그림 3-1-4. LB agar plate에 자란 colony의 예 187

그림 3-1-5. 배양 전/후 차이 187

그림 3-1-6. Human TPO cDNA plasmid의 enzyme digestion에 의한 product 확인의 예 188

그림 3-1-7. 세포의 군집 형태의 예 189

그림 3-1-8. 초음파기(Sonic Dismembrator) 190

그림 3-1-9. 후보 FTC-238/hrTPO 세포주의 TPO activity 측정 결과 예시 191

그림 3-1-10. SH-SY5Y 세포주 형태 192

그림 3-1-11. Experion을 이용한 RNA purity 측정의 예시 199

그림 3-1-12. Real-time RT-PCR data normalization의 예시 203

그림 3-1-13. Luciferase 활성을 통한 프로모터 활성 측정 예시 206

그림 3-2-1. 환경유해화학물질에 의한 TPO 활성 측정 결과 예시 209

그림 3-2-2. Steroidogenesis 관련 disruption 환경유해화학물질의 luciferase 활성을 통한 프로모터 활성 측정 결과 예시 212

그림 3-2-3. 환경유해화학물질에 의한 정소세포에서의 남성호르몬 감소 확인 예시 213

그림 3-2-4. Mouse에서의 환경유해화학물질에 의한 혈청과 정소에서의 남성호르몬 감소 확인 예시 214

그림 3-2-5. Gluconeogenesis 관련 disruption 환경유해화학물질의 luciferase 활성을 통한 프로모터 활성 측정 결과 예시 216

그림 3-3-1. Microarray를 이용한 유전자 발현 이미지 예시 221

그림 3-3-2. 각 유전자에 대한 3번 반복실험의 편차 예시 221

그림 3-3-3. 세 가지 그룹에 대해서 특이적인 발현변이를 나타내는 유전자들을 이용하여 pattern에 따라 sample 그룹화한 hierarchical clustering 예시 224

그림 3-4-1. 데이터 분석 전략 226

그림 3-4-2. GeneSpring에서의 TPO 활성 판별용 특이적 유전자 지표 발굴 예시 226

그림 3-4-3. GeneSpring 프로그램 실행 기본 창 227

그림 3-4-4. GeneSpring 분석 시 data column 지정 예시 228

그림 3-4-5. GeneSpring 분석 시 data 추가 예시 228

그림 3-4-6. GeneSpring 분석 시 experiment 정보 입력 예시 228

그림 3-4-7. GeneSpring 분석 시 new experiment checklist 화면 229

그림 3-4-8. GeneSpring 분석 시 normalization 화면 229

그림 3-4-9. GeneSpring 분석 시 parameter 지정 화면 229

그림 3-4-10. GeneSpring에서의 ANOVA 분석 예시 230

그림 3-4-11. GeneSpring에서의 class prediction 방법 231

그림 3-4-12. GeneSpring에서의 특이적 유전자 지표 검증 결과 예시 232

그림 3-4-13. 환경유해화학물질에 의한 steroidogenic enzyme의 유전자 발현 변화 확인 예시 235

그림 3-4-13. 환경유해화학물질에 의한 steroidogenic enzyme의 단백질 발현 변화 확인 예시 237

그림 3-4-14. Gluconeogenesis 관련 유전자의 환경유해화학물질에 의한 발현 변화 확인 예시 239

그림 3-5-1. Agilent in situ SurePring Technology 241

그림 3-5-2. CTT Array 디자인 241

그림 3-5-3. CTT Array 검증 예시 241