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SUMMARY

CONTENTS

목차

제1장 연구개발과제의 개요 22

제1절 연구개발의 목적 22

제2절 연구의 필요성 22

제3절 연구개발의 범위 23

제2장 국내외 기술개발 현황 24

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 28

제1절 저비용 고효율 톱밥표고 지면 재배 기술 원리 구명 28

1. 재료 및 방법 28

2. 결과 및 고찰 34

가. 참나무 톱밥 발효 특성 34

나. 참나무 톱밥의 발효 기간 및 적재 깊이에 따른 물리 화학성 변화 42

다. 참나무 톱밥 퇴적깊이에 따른 살균온도와 배양온도별 표고 균사생장 48

라. 종균+톱밥 배합기술 구명 53

마. 표고톱밥지면재배 55

바. 표고 톱밥 재배사 내외 온-습도 및 지면 배지내 온도, 수분함량 변화에 따른 표고버섯 발생 63

사. 표고 균사 생장에 따른 지면배지의 물리적 변화 71

아. 액체배지 조성 성분에 따른 표고버섯 균사 생장량 77

자. 톱밥표고 지면재배 공정의 기계화 81

차. 톱밥표고 지변재배 경영수지 분석 83

제2절 참나무 톱밥의 발효 원리 구명 84

1. 재료 및 방법 84

2. 결과 및 고찰 96

가. 참나무 톱밥 발효과정의 주요 세균군집 96

나. 참나무 톱밥 발효관련 미생물 구명 118

다. 참나무 톱밥 발효 종균제의 개발 130

제3절 톱밥표고 지면재배 기술 실용화 145

1. 재료 및 방법 145

2. 결과 및 고찰 149

가. 접종원(종균) 대량배양 용기 개발 149

나. 대량생산 접종원의 효과 검정 150

다. 표고 액체 접종원 생산기술(액체배양용 최적배지 선발) 152

라. 혐기성 발효톱밥 및 일반톱밥의 효과 비교 154

마. 발효배지와 종균의 적정혼합비율 구명 155

바. 배지내 적정통기 방법 구명 157

사. 혐기성 발효톱밥을 사용한 배지 제조 시 저온살균 효과 검정 158

아. 재배 적합 품종의 탐색 160

자. 지면평상재배 환경조절 시스템 구축 163

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 164

제5장 연구개발결과의 활용계획 166

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 178

제7장 참고문헌 181

부록 : 자료 사진 190

I. 제목

혐기성 발효 참나무톱밥을 이용한 저비용-고효율 표고 지면재배 기술

II. 연구개발의 목적 및 필요성

1. 목적

당 연구의 목적은, 저비용-고효율 톱밥표고 지면재배법을 실용화하기 위한 것으로, 참나무 톱밥의 혐기성 발효와 저온 살균 효과를 구명하고, 이를 톱밥 표고 지면재배에 응용하며, 재배공정에서 노동력을 줄이는 기계화과정을 개발하는 것이다.

2. 필요성

기존 톱밥 표고재배는 배지준비와 버섯발생관리, 수확면에서 고압멸균시설 등으로 투자가 막대하고, 뒤집기 작업 등으로 에너지와 노동력이 크게 요구되므로 이에 대한 개선이 상당히 필요하다. 기존 톱밥재배 중에서 균상재배는 배양 중에는 잡균오염 확률이 높으며, 버섯발생처리에서 수분관리와 수확관리에서 발생버섯밀도 조절 등으로 노동력과 노동시간이 크게 요구되며, 기존 톱밥재배 중에서 균상재배는 배양 중에는 잡균오염 확률이 높으며, 버섯발생처리에서 수분관리와 수확관리에서 발생버섯밀도 조절 등으로 노동력과 노동시간이 크게 요구된다.

톱밥표고 균상재배는 톱밥배지를 내열성 비닐 봉지에 넣어서 고압살균기에서 121℃에서 멸균한 후 표고종균을 접종하여 약 100일간 배양한 후 봉지 전체를 개방하여 표고를 발생시키고 수확하는 방식으로 버섯이 온 방면으로 다 발생하여 계속 키우기가 어렵고, 수분이 부족하기 쉬워서 상품성 있는 버섯으로 만들려면 수시로 솎아내고, 균상 한 개씩 잡고 수분공급을 하여야 한다. 톱밥표고 봉지재배는 위 균상재배를 개선한 것으로 배지준비와 버섯발생처리 및 수확이 수월하여 생산성과 수익성이 크게 향상되었으나, 이 방법에서는 버섯이 봉지 내 측면에서 다량발생하고 상면이 오염되면 회복이 매우 어려워 버섯 수확이 되지 않아 실패확률이 높다.

봉지재배는 100℃에서 약 10시간 살균 후 표고를 접종하여 약 100일간 배양 후 봉지를 상면만 개방하여 버섯을 발생시키는 것으로 수확이 수월하지만, 상면발이를 유지하려면 뒤집기 작업을 계속해야 한다.

따라서 위 두가지 방법을 획기적으로 개선하여, 표고 톱밥배지준비에서 에너지 소비를 줄이고, 배양 중에는 봉지를 사용하지 않으면서 표고균에게는 유리하고 오염균의 생장을 감소시키는 톱밥배지가 필요하고, 버섯발생과 수확에 수월한 저비용-고효율 표고 지면재배법이 한 표고재배자에 의하여 개발되었다.

하지만 현재로서는 이 톱밥 지면재배법이 톱밥의 혐기성발효, 저온살균 등에서 과학적으로 정립되지 못한 면이 있고, 지면재배과정이 수작업으로 이루어져 노동효율성면에서 개선과 향상이 크게 요구되고 있으므로 이 혐기성발효 톱밥을 이용한 표고 지면재배기술을 과학화, 일부 기계화하기 위하여 연구를 추진하였다.

III. 연구개발 내용 및 범위

1. 저비용-고효율 톱밥표고 지면재배 기술 원리 구명

- 혐기성 발효 톱밥의 특성 구명

- 참나무톱밥의 혐기성 발효 원리 구명

- 저온 살균된 혐기성 발효배지의 표고생장 촉진 및 잡균 감소 원리 구명

- 혐기성 발효배지를 이용한 표고 지면재배 공정 구명

- 표고 지면재배 공정의 기계화

2. 참나무톱밥의 혐기성발효 원리구명

- 혐기성 발효 관련 균의 동정 및 생태 구명

- 혐기성 발효 미생물의 증식 보존 기술 및 효율 향상 기술 개발

3. 톱밥표고 지면재배 기술 실용화

- 혐기성 발효 톱밥의 표고 재배 효율성 향상

- 표고 지면재배 기술의 실용화 기술 개발

IV. 연구개발 결과

1. 저비용 고효율 톱밥표고 지면 재배 기술 원리 구명

가. 참나무톱밥의 혐기성 발효 원리 구명

표고 재배에 이용되는 참나무 톱밥의 발효 원리를 구명하기 위하여 충북 증평의 한솔 농장에서 11ton의 참나무 톱밥에 발효동안 물리화학적 변화를 조사하였다. 깊이와 기간별 발효 특성은 적재 초기에는 함수율이 깊이별 30%로 일정하였지만 온도와 pH는 상부에서 하부로 갈수록 낮았다. 적재 10일 이후 온도는 하부로 갈수록 높아졌으며, 함수율은 상면이 급격히 감소하여 11%였고, 중부 하부는 30%를 유지하였다. pH는 하부는 pH4.3 상부와 중부는 pH5.5이었다. 발효 10~38일 기간에 깊이 40~100cm에서의 온도는 52~61℃로 pH는 4.3~4.7로 유지되었다.

나. 혐기성 발효 톱밥의 특성 구명

참나무 발효 톱밥의 특성을 조사한 결과 톱밥의 목부 도관 내에는 균사가 있었고, 유세포 내 전분은 거의 존재하지 않았다. 참나무 발효 톱밥의 열수추출액 삼투압 농도는 발효 기간, 적재 깊이에 따라 41.5~44.2mmol/kg로 차이가 없었다. 탄소는 적재 후 약 20일동안 표면~20cm 깊이에서는 76.8%에서 55.9%, 40~60cm 깊이에서는 68.5%에서 62.5%, 80~100cm 깊이에서는 66.2%에서 64.8%로 표면에서 내부로 들어갈수록 탄소감소량이 적어졌다. 질소는 적재 후 약 57일 동안 표면~20cm, 40~60cm, 80~100cm 깊이에서 0.19%~0.25%로 차이는 없었다. C/N률은 적재 후 약 20일이 경과한 톱밥의 모든 깊이에서 300에 가까웠다.

다. 저온 살균된 혐기성 발효배지의 표고생장 촉진 및 잡균 감소 원리 구명

참나무톱밥배지를 65℃, 100℃, 121℃로 살균한 후, 표고톱밥종균을 접종하고 15℃, 20℃, 25℃, 30℃에서 배양하고, 표고종균의 접종간격을 1cm, 2cm, 4cm(표면적 비율은 4%, 11%, 25%)로 하여 표고균사의 생장과 배지의 오염정도를 비교하였다. 저온 살균된 배지에서 표고균사생장은 배양온도 25℃ 이하에서는 100℃나 121℃ 살균된 배지에서처럼 양호하였으나, 30℃ 배양에서는 표고균사생장이 크게 위축되었다. 그리고 저온살균배지에서 표고종균 접종밀도를 1cm 간격으로 하였을 때에는 배지가 표고균사로 완전 점유되었으나, 2~4cm 간격 접종밀도에서는 14~33%의 배지가 오염되었다. 표고 균사 배양 시 오염균은 발효단계에서 발견되는 Rhizopus sp와 Trichorderma sp가 주로 발견되었다.

라. 혐기성 발효배지를 이용한 표고 지면재배 공정 구명

표고톱밥지면재배 시 톱밥배지의 함수율을 65%로 맞추어 65℃ 저온살균 후 종균을 접종한 지면배지는 78일 동안 함수율이 61%~72%, pH는 종균 접종전에 5.6이었으나, 3.9~4.6로 낮아졌다. 배양기간중 배지내 에르고스테롤 농도는 0.33㎍/g 0.59㎍/g 변동이 있었다. 표고톱밥지면재배사내 온도는 7.1~29℃, 습도는 27.3~100%였고, 톱밥배지내의 온도 변화범위는 11.6~30℃이었으며, 수분함량 변화범위는 60~65%사이였다.

표고발생은 3월말에 입상한 후, 약 120일 지난 7월 말경부터 시작되어 그후 약 100일 동안, 12월초까지 8주기에 걸쳐 관수처리하면서 발생 수확하였다. 지면재배에서 주기별 총 표고수확량은 1주기(7/29~8/4) 352kg, 2주기(8/17~8/22) 288kg, 3주기(9/3~9/7) 320kg, 4주기(9/19~9/24) 800kg, 5주기(10/3~10/8) 1,296kg, 6주기(10/17~10/22) 1,853kg, 7주기(11/4~11/9) 1,476kg, 8주기(11/23~12/7) 990kg로, 농장 전체 약 33.0톤의 톱밥에서 약 8.4톤의 표고를 수확하여 톱밥배지의 버섯생산 효율은 약 25.5%였다.

표고 지면배지에 자실체가 발생하는 부분의 갈변층의 총 두께는 약 0.34㎛, 경도 0.7kgf/㎠였고, 표면은 표고균사로 덮혀 있었다. 반면, 자실체가 발생하지 않는 부분의 갈변층 총 두께는 약 1.17㎛, 경도 0.91kgf/㎠였고, 표면은 막처럼 매끈하였고, 그 위에는 세균이 점유하고 있었다.

마. 표고 지면재배 공정의 기계화

표고지면재배의 공정은 톱밥배지의 혐기성 발효와 저온살균-종균배양-배양종균의 파쇄 후 배지와의 배합-재배사내 입상-비닐덮기-균사배양-비닐제거-물관리-버섯발생관리-8주기 반복의 수확과정을 거친다. 이중에서 효율을 높이기 위한 기계화가 필요한 과정은 저온살균과 접종원과 배지의 혼합과정으로 전자는 배지 콘테이너와 로더를 이용하고, 후자에서는 콘베이어가 부착된 배합기를 이용하였다.

2. 참나무 톱밥의 발효 원리 구명

가. 혐기성 발효 관련 균의 동정 및 생태 구명

2009년, 2010년 참나무 톱밥 발효과정의 세균군집을 조사하여 발효에 주요 역할을 하는 세균군집을 확인하였다. 2009년도에는 Amycolatopsis 속과 Clostridium 속의 세균이 우점하였고, 2010년도에는 Amycolatopsis 속과 Alicyclobacillus 속의 세균이 우점하였다. 혐기성 환경에서 생장하는 Clostridium 속은 톱밥의 혐기적 발효에, 고온 및 산성, 호기적 환경에서 생장하는 Alicyclobacillus 속은 참나무 톱밥의 발효과정에서 관찰되는 온도 상승 및 산성 환경에서 생장이 유리하여 내부 호기적 발효에 관여할 것으로 생각된다. 특히, 2009년과 2010년도 시료에서 공통으로 확인된 Amycolatopsis 속은 cellulose를 분해하고, 항생물질을 생산하는 특성이 보고되어 톱밥배지의 발효 및 연화에 관여하는 주요 세균이라 생각되며, 군집구조에서 확인된 세균의 염기서열은 Amycolatopsis taiwanensis와 진화적 거리가 가장 가까웠다.

참나무 톱밥 발효배지의 살균온도에 따른 세균 군집 구조의 변화를 조사한 결과, 살균 전 톱밥에는 다양한 미생물이 존재하였으나, 살균 후 세균 군집 구조의 단순화가 관찰되었다. 65℃ 저온살균의 경우, Acinetobacter 속과 Pseudomonas 속의 개체군 감소와 Burkholderia 속의 우점이 관찰되었다. 75℃ 살균의 경우 Bacillus 속이 85℃와 95℃ 살균의 경우 Pullulanibacillus 속이 우점하였다. 특히, 75℃ 이상 살균 톱밥에서 우점한 Bacillus와 Pullulanibacillus는 내생포자를 형성하는 그람양성 세균으로 고온에 유리한 장점을 가지고 있다. 향후 표고 재배에 대한 살균 온도의 영향에 관한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

참나무 톱밥 발효 시료로부터 주요 발효 미생물인 Amycolatopsis 속의 2 균주(Amycolatopsis sp. OSD-1과 OSD-2), Alicyclobacillus 속의 1 균주(Alicyclobacillus sp. OSAB)를 분리하였고, 특성을 조사하였다. Amycolatopsis sp. OSD-1과 OSD-2 균주는 ISP 2 배지에서 황색, 부정형의 가장자리, 원형 콜로니를 형성하는 그람양성, 호기성 방선균으로 40℃, NaCl이 포함되지 않은 배지, 중성 pH에서 가장 잘 생장하였다. 균사체는 크기가 작으며(0.4㎛x1.1㎛), 분지가 일어나고, 사슬처럼 길게 이어진 squarish rod-shape로 표면이 매끄러웠다. Amycolatopsis sp. OSD-1과 OSD-2의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석결과, A. taiwanensis와 유연관계가 가장 가까웠으며, 94% 이하의 유사도를 보였다. Amycolatopsis sp. OSD-2의 경우, G+C 함량은 70.2%로 Amycolatopsis 속의 다른 종보다 높고, DNA 근연도는 A. taiwanensis와 53.1%로 가장 높았다. 또한, Amycolatopsis sp. OSD-2의 퀴논(MK-9), 세포내 당 구성 (galactose, glucose), 주요 지방산(iso-C16:0, 2-OH iso-C16:0, cis 9-C16:1)의 특징은 Amycolatopsis 속과 일치하였다. Amycolatopsis 속의 표준 균주들과 달리, 탄소원으로 Amycolatopsis sp. OSD-1는 fructose를 이용하지 못하였고, Amycolatopsis sp. OSD-2는 glycerol을 이용하지 못하지만 sorbose, dulcitol, inositol을 이용하였다. 참나무 톱밥 발효에서 분리된 주요 미생물 Amycolatopsis sp. OSD-1과 OSD-2은 Amycolatopsis 속의 다른 종과 구분되는 생리·생화학적 특징, 97% 이하의 16S rRNA 유전자 염기서열의 유사도 및 70% 이하의 DNA 근연도에 의거하면 Amycolatopsis 속의 신종이라 판단된다.

Alicyclobacillus sp. OSAB는 BAM 배지에서 평편한 융기상, 유회색의 불투명한 원형 콜로니를 형성하였다. 0.8㎛x2.8㎛ 크기의 그람양성 간균으로 영양세포의 끝부분에 내생 포자를 형성하였다. 최적 생장 온도 및 pH, 염도는 각각 50℃, pH 4, 0.5% NaCl이었으며, oxidase와 catalase 음성이었다. 탄소원 분석결과와 16S rRNA 유전자 염기서열 분석결과, Alicyclobacillus sp. OSAB는 Alicyclobacillus contaminans와 유연관계가 가장 가깝고, 99% 유사도를 보이므로 Al. contaminans의 한 균주로 생각된다.

나. 혐기성 발효 미생물의 증식 보존 기술 및 효율 향상 기술 개발

참나무 톱밥 발효로부터 분리한 주요 미생물 Amycolatopsis sp. OSD-1과 OSD-2, Alicyclobacillus sp. OSAB를 참나무 톱밥에 접종하여 발효과정 동안의 세균수의 변화, 효소활성도, 톱밥의 구조 변화를 관찰하였다. 접종 효과 관찰 결과, 대조군 및 Amycolatopsis sp. OSD-1과 Alicyclobacillus sp. OSAB보다 Amycolatopsis sp. OSD-2가 빠른 생장 속도 및 적응력으로 발효 효과가 관찰되었다.

톱밥 발효 효율의 증대가 기대되는 Amycolatopsis sp. OSD-2를 참나무 톱밥 발효 종균제(미생물제제) 균주로 선정하고, 참나무 톱밥에 접종하여 톱밥 발효에 대한 미생물제제의 효과를 확인하였다. 또한, 동결건조 방법을 도입하여 참나무 톱밥 발효 미생물제제를 개발하고 시제품을 제작하였으며, 장기보관, 운송 및 사용의 편의성을 높였다. 정지기까지 배양하여 수확한 Amycolatopsis sp. OSD-2에 skim milk(최종농도 15%)에 15분 처리하고 -70℃에서 동결 및 건조하였으며, 건조중량 0.165g/mL의 동결건조체를 확보하였다. 동결건조 균체는 1.0x1011cells/g 이상으로 50% 이상의 생존율을 가지고 있다. 확보된 Amycolatopsis sp. OSD-2의 동결건조 조건을 토대로 참나무 톱밥 발효 종균제의 시제품을 제작하였다.

또한, 참나무 톱밥 발효 미생물제제를 제품화하기 위하여 미생물제제를 ALEC이라 명명하였으며, 사용법 및 보관 조건 등을 제시하였다. 참나무 톱밥 발효 종균제(미생물제제) ALEC은 1g을 물 60mL에 현탁하여 6kg의 톱밥에 접종(1.0x108cells/g)하여 사용하며, 밀봉하여 습기가 없는 상온에 보관한다. 장기보관 할 경우 냉장 혹은 냉동 보관을 권장한다. 위 결과를 토대로, 표고톱밥 배지 생산 시 오염 및 에너지의 절감 효과뿐 아니라, 저비용-고효율의 표고톱밥 배지의 생산을 기대할 수 있을 것이다.

3. 톱밥표고 지면재배 기술 실용화

가. 혐기성 발효 톱밥의 표고 재배 효율성 향상

표고접종원(종균)을 대량배양하기 위한 용기로는 1.5kg 원통형 배지(Ø120mmxH230mm)에는 20~25mm직경의 종이필터를 부착하는 것이 적당하였고, 이로써 접종원(종균) 생산의 기계화가 가능하였다. 종이 필터를 사용한 용기와 기존 병종균 용기의 효과에는 차이가 없었다. 배지의 버섯회수율면에서 혐기성 발효톱밥 첨가배지는 30.7%, 일반 참나무 톱밥 첨가배지는 26.4%로 차이가 없었다. 각 처리구들 간에 배지의 오염정도, 균사 활착 속도, 버섯발생 정도에도 차이가 없었다. 배지와 종균의 적절 혼합비는 30%이며 이보다 낮으면 오염이 심하였다.

나. 표고 지면재배 기술의 실용화 기술 개발

배지내 적정 통기성은 입상 10~15일차 사이에 배지 표면을 비닐과 함께 살균된 도구를 이용하여 2~3cm 간격으로 뚫어주는 것이 효과적이었다. 혐기성 발효톱밥을 사용한 배지 제조 시 저온살균 효과를 종합적으로 관찰하였을 때 혐기발효톱밥을 고온(100℃)살균한 처리구와 저온(65℃)살균한 처리구간에 균사활착 오염정도에서는 차이가 없어 저온 살균만으로도 표고균사의 배양 및 버섯수확에 문제가 없음을 확인하였다. 버섯 수확량은 저온살균 처리구가 23.7%로 고온살균 처리구 16.8%보다 높았다.

재배에 적합 품종을 배양기간, 버섯발생, 해균발생정도 등을 종합적으로 비교하였을 때 참아람 품종이 가장 우수하였으며, 우리나라 간이 재배사 재배환경에 적합할 것으로 판단된다. 하지만 참아람은 중온성 품종으로 고온기 버섯발생에 불리하므로 중고온성인 산조 701호와 병행 재배하면 춘기부터 늦은 추기가지 안정적인 버섯 수확이 가능할 것으로 판단된다. 지면평상재배 환경조절 시스템면에서는 버섯회수율은 간이재배사 다단식 재배에서 24.9%로 공조재배사에서 15.5%보다 높고, 버섯개체중도 간이재배사 처리구가 22.5g으로 공조재배사 18.8g인 보다 우수하였다.

V. 연구결과 활용에 대한 건의

본 연구에서는 참나무 톱밥 33톤을 혐기성 발효하여 65℃ 저온살균하여 지면재배한 결과 약 8.4톤의 표고를 생산 (25.5% 효율)하였다. 이는 그동안 연구된 톱밥의 혐기성 발효의 근본 원리, 관여 미생물, 배지의 특성, 표고균사의 생장관계 구명과 공정의 반자동화 개선 등에 의한 것이다. 이 연구결과는 저온살균된 톱밥의 지면재배방법에 관한 특허와 관여 미생물종에 대한 특허출원으로 이어졌다.

한편 혐기성 발효배지의 생산성 극대화와 재배공정의 확립으로 연중 표고생산 기술의 안정화를 추구할 필요가 있다. 특히 2010과 2011년도에는 봄~여름철 장기고온 현상에 의하여 표고발생이 크게 불리한 상황을 어렵게 극복하였으므로, 앞으로 표고의 연중 재배기술을 획기적으로 발전시킬 것으로 판단된다.

이번 연구에서 달성된 톱밥배지의 표고생산 효율 26%는 매우 고무적인 것이나, 여름철 고온으로 버섯발생이 지연되고, 표고균의 퇴화가 우려되는 점이 있었다. 따라서 생산성 효율을 개선 향상시킬 환경조절 설비연구가 필요하다고 판단된다. 이 연구의 일부 결과는 버섯관련 국내외 전문학술대회에 발표하였고, 학회지에 논문 제출하였으며, 표고재배자들과 연구자들에게 성과설명회를 하였다. 차후 홍보매체에 홍보할 것이다. 그리고 종합적으로 경제성 분석을 한 결과 1,901만원 비용투입에 대하여 29,740만원의 편익을 얻었으므로 편익/비용(B/C)는 1.56으로 톱밥표고 봉지재배에서 높은 수준이었다.

3년간의 연구에서는 기술의 안정화, 여름철 고온기의 장기화, 배지의 효율 향상 등에 대한 설비투자가 부족한 면이 있었다. 또한 시작품으로 제작된 종균과 배지의 배합기와 톱밥발효 및 저온살균기 시설의 개선과 발효미생물 시제품의 현지 적용성 연구가 요구된다.