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요약문
SUMMARY
CONTENTS
목차
제1장 연구개발과제의 개요 14
제1절 연구개발의목적 14
제2절 연구개발의 필요성 15
1. 기술적 측면 15
2. 경제·산업적측면 22
3. 사회·문화적측면 28
제3절 연구개발의 범위 30
제2장 국내외 기술개발 현황 31
제1절 국외 연구기관의 기술개발 현황 31
제2절 본 연구기관의 기술개발 현황 40
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 47
제1절 연구수행방법 47
제2절 연구내용 60
제3절 연구결과[원문불량;p.112] 67
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 222
제5장 연구개발결과의 활용계획 240
제1절 추가연구의 필요성 240
제2절 타연구에의 응용 241
제3절 기업화 추진방안 242
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 244
1. 외국의 경우 244
제7장 참고문헌 251
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I. 제목
선천성 면역반응 제어 원천 기술 개발 연구
II. 연구개발의 목적 및 필요성
o 제 1 세부과제 : 선천성 면역 제어 기능을 가진 신규 agonist 및 antagonist 물질 발굴, 그 작용 기전 규명 및 숙주 유래 세균 인식 단백질에 의한 선천성 면역 제어 기전 규명 연구를 통한 신규 감염 진단 키트 개발, 감염/면역 질환 치료제, 면역 증강제 개발에 응용 가능한 원천 기반 기술 확보. 따라서 본 연구에서는 선천성 면역 반응을 조절하는 Toll-like receptor (TLR) 단백질에 agonist 나 antagonist 로 작용하는 새로운 ligand 탐색 및 그 작용 기전 규명 연구는 새로운 면역/감염 질환 치료제 나 vaccine 등의 면역 증강제 개발의 원천 기반 기술로 활용하고자 함. 또한, 세균의 세포벽성분을 선택적으로 인식하여 선천성 면역을 유도하는 세포벽 성분 인식단백질들의 작용 기전규명은 새로운 면역 치료제 및 감염 진단제 개발의 원천기술로 활용할 수 있음.
o 제 2 세부과제 : 인간 TLR9에 특이적으로 결합하는 부작용을 최소화하고 효율적이며 경제적인 리간드를 탐색하고, 이를 이용하여 단백질 항원과 바이러스 백신의 면역보조제 및 알러지성 면역질환의 치료에 응용할 수 있는 원천기반기술을 구축하고자 함. 인간 TLR9의 리간드를 3종 이상 발굴하고 이들에 의한 선천성 면역조절기전을 규명하여, Th1/Th2 면역 반응을 30%이상 변환 시키고 항체 생산능력을 50% 이상 증가시키는 백신효율 증강제로 이용하기 위한 타겟 발굴 및 선천성 면역기능제어 메카니즘을 규명함.
o 제 3 세부과제 : Innate immunity의 가장 대표적인 세포인 macrophage의 death/survival, 그리고 innate immunity의 agonist의 자극에 의한 반응을 modulate 하는 TLR tolerance 현상을 규명하고 그 signal transduction을 밝혀 염증/면역 반응을 조절하는 원천 기술을 확보하고 이를 이용한 면역 질환 및 비면역계 염증 관련 질환에 대한 새로운 개념의 치료제 개발을 시도함.
III. 연구개발의 내용 및 범위
o 제 1 세부과제
- S. aureus 세포벽 성분으로부터 32 kDa의 신규 lipoprotein 대량 정제 및 그 기능 조사
- 신규 lipoprotein의 MS 분석 및 순도검증
- 신규 lipoprotein의 TLR2 wild 마우스 및 TLR2 KO를 이용한 in vivo 기능 조사
- 신규 lipoprotein 유래 lipopeptide 의 합성 및 그 생물 활성 조사
- 마우스를 이용한 신규 TLR lipoprotein agonist가 면역 세포의 증식 및 후천성 면역 반응에 미치는 영향 조사 연구
- TLR KO 마우스를 이용한 신규 TLR lipoprotein agonist에 의한 면역반응 활성화 분석
- 신규 TLR agonist로 작용하는 그람 양성균의 lipoprotein 의 정제 및 그 생화학적 특성규명
- 그람 양성균의 야생형 균주와 선택적 세포벽 변이주를 이용한 사람 lectin 보체계를 활성화 시키는 새로운 ligand 구조 탐색
- 생화학적 접근법과 세포 생물학적 접근법을 통한 사람 보체계를 선택적으로 활성화시키는 새로운 ligand 규명 및 그 활성화 기전 규명
- 사람 lectin 보체계를 활성화를 조절하는 새로운 인자의 규명
- 곤충의 Toll 과 proPO cascade 활성화 조절인자의 탐색 및 그 생화학적 특성 규명
- 곤충의 Toll 과 proPO cascade 활성화 조절인자의 활성화 조절 기전 규명
- 신규 DAP-PGN 인식단백질의 정제 및 그 생화학적 특성 규명
- 신규 DAP-PGN 인식단백질의 인식 활성화 기전 규명
o 제 2 세부과제
- 마우스에서 TLR9의 신규 리간드에 의한 면역반응 조절 분석
- 마우스에서 TLR9의 신규 리간드의 백신효율 증강제 기능 분석
- 리포좀-CpG-DNA-단백질 항원 복합체의 면역증강제 효능 평가
- 리포좀-CpG-DNA-에피톱 복합체의 면역증강제 효능 평가
- 리포좀-CpG-DNA-에피톱 복합체의 백신효능 평가
- 리포좀-CpG-DNA 복합체의 종양 치료효능 평가 및 기전 연구
o 제 3 세부과제
- Macrophage에 innate immunity의 가장 중요한 receptor인 TLR에 대한 agonist를 반복 처리 할 경우에 inflammatory response가 감소하는 현상 즉 TLR tolerance은 현상 및 그 이용에 대하여 연구한 바 있음.
- 본 2 단계 연구에서는 최근 중요성이 크게 알려져 가고 있는 TLR 및 non-TLR ligand 를 이용한 macrophage tolerance 현상의 기전 및 signal transduction을 규명하고 이를 조절하는 방법을 개발함으로써 macrophage의 기능을 조절하는 한편 이 현상과 기전을 이용하여 1형 당뇨병의 발생을 억제하는 것 뿐 아니라 DPP4 inhibitor와 병합 투여하여 사람에서의 경우와 비슷한 이미 발생한 1형 당뇨병을 치료하는 방법을 개발.
- 2형 당뇨병과 관련하여 Paneth cell 등 intestinal innate immunity의 변화가 high-fat diet 처리 후 가장 먼저 발생하는 event 의 가능성 및 이에 의한 endotoxinemia, low grade inflammation의 pathogenetic role를 규명하는 한편 이를 reverse 하는 방법을 개발.
- 이와 더불어 본 연구는 중추신경계의 macrophage인 microglia 세포를 대상으로 survival/death를 조절하는 방법, polarization을 제어하는 물질 및 방법 등도 개발.
IV. 연구개발결과
- TLR2의 신규 agonist 로 작용하는 그람양성균의 lipoprotein의 생물학적 기능 규명
: 포도상 구균의 Sit C lipoprotein이 TLR-2 agonist로 작용하는 사실을 최초로 규명하였고, 나아가 본 연구진은 포도상 구균의 Sit C mutant (△ sit C)를 제작하여 TLR-2 활성화 여부를 조사하여 박테리아 lipoprotein이 TLR-2의 주된 ligand 물질임을 증명하였음
: 먼저 △Sit C 균주에서 insoluble PGN을 분리하여 TX-114를 처리한 후 Sit C 존재 여부를 조사한 결과 mutant 균주에서는 Sit C 단백질이 관찰되지 않았지만, Sit C 유전자를 다 시 Sit C mutant 에 도입한 균주로부터 Sit C의 단백질을 분리하여 TLR-2 활성을 조사한 결과 wild-type 포도상 구균과 거의 비슷한 정도로 TLR-2를 활성화시키는 사실로부터 본 연구진은 bacteria genetic 기법을 이용하여 lipoprotein이 TLR-2 의 ligand 임을 증명하였음
: Sit C lipoprotein은 포도상 구균에서 TLR-2의 주된 agonist 로 작용하는 사실을 기반으로 하여 본 연구진은 다시 새로운 16 종류의 박테리아의 lipoprotein들을 분리하여 이들의 구조를 mass 로 결정하였고, TLR-2 receptor 활성화와 그 신호 전달 체계를 명확히 규명하였음
- 사람의 보체계를 선택적으로 활성화 시키는 MBL 단백질의 새로운 그람 양성균의 ligand 규명 및 그 생물학적 기능 규명
: S. aureus 의 야생형 균주와 특정 세포벽 성분만을 결손 시킨 변이주의 정제된 세포벽과 재조합 MBL 단백질의 결합능력을 체크한 결과, tagO 유전자가 결손되어 WTA를 생성하지 못하는 변이주는 MBL과 특이적으로 결합하지 못한다는 사실과 하위인자인 C4를 활성화 시키지 못한다는 사실을 규명.
: 또한 호중구 세포에서 MBL 이 매개 수용체로 유발되는 옵소닌과 대식작용을 통한 면역 활성화 기전 또한 WTA가 존재 하는 조건하에서 유도된다는 사실도 확인하였고, 흥미롭게도 성인의 혈액속에서는 anti-WTA-IgG가 생성되어 MBL 보다보다는 강한 결합력을 거지면서 S. aureus WTA/anti-WTA-IgG mediated classical complement pathway 가 선택적으로 활성화되는 새로운 사실도 규명.
: 본 연구진이 분리한 S. aureus WTA가 mouse 내에서 어떤 IgG를 생성하고 methicillin-resistant S. aureus (MRSA)균 감염시에 protection 효과가 있는지를 조사한 결과 protection 효과가 있는 사실을 증명.
: 최근에는 사람의 MBL 단백질 및 anti-WTA-IgG가 인식하는 WTA epitope를 결정하는데 성공
: Peptidoglycan recognition protein-SA (PGRP-SA)는 선천성 면역 반응에서의 인식의 다양성을 나타내며 특히, 그람 음성균과 몇몇의 그람 양성균이 가지는 polymeric DAP-type PGN에 대한 인식 단백질로 작용하여 그람 양성균의 Lys-type과 동일한 complex를 형성한다는 사실과 하위 serine protease 의 활성화를 유도해 Toll pathway 과 proPO system을 활성화 시킨다는 사실을 규명
- 리포좀-CpG-DNA의 단백질 항원에 대한 면역증강제 효능 기전 규명
: 리포좀-CpG-DNA 복합체를 adjuvant로 이용하여 복강에 투여하였을 때, HEL 및 OVA에 특이적인 항체의 생산이 크게 증가함을 확인
: 펩타이드를 항원으로 이용하였을 때, 리포좀-CpG-DNA를 adjuvant로 이용하며 다른 carrier 단백질 없이도 에피톱에 특이적인 항체가 생산됨을 확인
: 리포좀-CpG-DNA-HEL 복합체 투여에 의한 HEL-특이적인 항체 생산이 TLR9 knockout mouse에서는 현저히 감소함을 확인하여 TLR9 의존적임을 확인
: 리포좀-CpG-DNA-단백질 복합체 투여에 의한 단백질 특이적인 항체 생산이 MHC 및 Thl differentiation 의존적임을 MHC knockout 마우스 및 STAT4 knockout 마우스 등을 이용하여 확인
- 리포좀-CpG-DNA-에피톱 복합체를 이용한 암 특이적 항원의 항체 생산, 항암효능 규명 및 백신 효능 규명
: HCV-E2 202 및 RSV-G1 펩타이드에 대한 항체가 에피톱-CpG-DNA-리포좀 복합체 제조하여 복강 투여하였을 때 가장 높게 생산됨을 확인
: 간암 특이적인 TM4SF5의 에피톱에 대한 리포좀-CpG-DNA의 면역보조제 효능을 평가
: 리포좀-CpG-DNA-에피톱 복합체 투여에 의한 에피톱-특이적인 항체 생산의 TLR9 의존성 확인
: 리포좀-CpG-DNA-에피톱 (단백질) 복합체 투여에 의한 에피톱 (단백질)-특이적인 항체 생산의 MHC 의존성 확인
: 리포좀-CpG-DNA의 단백질 항원 및 에피톱에 대한 면역증강제 효능 기전 규명
: Thl 분화와의 관련성 확인, CD4+ T 세포의 관련성 확인, TCR 의 관련성 확인, IL-12 의 관련성 확인, IFN-7 의 관련성 확인.
- 리포좀-CpG-DNA-에피톱 복합체를 이용한 암에 대한 백신 효능 평가
: Allograft mouse model에서 백신 효능 평가
: 리포좀-CpG-DNA-에피톱 복합체를 이용한 암에 대한 백신 효능의 TLR9 의존성 확인
: 리포좀-CpG-DNA-에피톱 복합체 백신의 간암에 대한 치료백신 효능 평가
: 리포좀-CpG-DNA-에피톱 복합체 백신의 간암에 대한 기억기능 (memory) 평가
- 신규 CpT motif의 면역반응조절물질에 의한 면역반응 조절 기전 분석 및 리포좀-CpT motif-에피톱 복합체의 백신 효능 평가
: 마우스에서 리포좀-CpG-DNA 복합체에 의한 면역반응 활성화는 TLR9 의존적임을 TLR9 knockout 마우스를 이용하여 확인함.
: 리포좀-CpT motif 면역조절물질(SACT4501)을 adjuvant로 이용하였을 때도 HEL에 특이적인 항체의 생산이 크게 증가함을 확인
: CpT motif 면역조절물질에 의한 면역반응 조절 기전 분석 : 수지상세포에서의 신규 CpT motif의 기능 분석
- CpG-DNA- liposome complex의 종양 치료 기전 규명 및 치료효능 평가
: 종양치료효능검정
: 림프구 의존성 검정
: CpG-DNA 투여 경로에 따른 항암효과 검정
: CpG-DNA에 의해 유도되는 종양에 대한 면역 기억 확인
: Liposome complex에 의한 수지상 세포 활성화 확인
: Chemokine 발현 양상 검정
: CpG-DNA에 의한 종양내 Treg recrutement 억제
- TLR2 tolerance와 DPP4 inhibition의 병합으로 기존에 1형 당뇨병을 발생전 억제하는 것에서 일보 전진하여 이미 발생한 1형 당뇨병을 치료하는데 성공.
- Non-TLR ligand는 in vitro에서는 작용하나 in vivo에서는 작용하지 않음을 관찰.
- HFD 후 intestinal innate immunity가 변하여 systemic low-grade inflammation, insulin resistance가 오는 것을 관찰하였고 antibiotics 치료하여 이를 reverse하여 새로운 치료 model 정립함.
- Microglia의 polarization, tolerance 등 표현형을 관찰할 수 있는 in vitro 및 in vivo 모델을 확립하고 이를 이용하여 특정 유전자의 기능 및 신호전달경로를 연구하였으며, polarization pattern을 성공적으로 규명함.
V. 연구개발결과의 활용계획
1) 본 연구결과에서 제시한 사람의 lectin 보체계를 활성화 시킬 수 있는 새로운 S. aureus의 ligand 인 WTA 와 그 상관관계의 규명은 감염질환 및 선천성 면역질환 지료를 위한 면역 치료제 및 새로운 백신 개발에 유용한 원천 기술로 이용될 수 있을 것이다. 또한 새롭게 밝혀진 면역글로블린 매개에 의한 WTA 인식 보체계 활성화 기전을 규명함은 나아가 항체를 이용한 특이적 면역 인자 결손 질환 환자들의 선택적 면역 치료제로서의 활용가치를 부여함. 또한 PGN 인식 단백질과 그 인식 ligand의 생물학적 기능 규명과 그 기전 규명은 proteolytic cascade를 활성화 기반으로 하는 다양한 생체 내 반응의 과도한 활성화를 조기에 조절할 수 있는 치료제 개발에 응용할 수 있을 것이라 판단되며 또한 그람 음성균의 DAP-type PGN 인식 선천성 면역 반응 기전의 규명을 통해 그람 음성 병원체 감염을 조기에 진단 할 수 있는 진단 kit의 개발에 응용될 수 있을 것이라 판단됨,
2) 리포좀-CpG-DNA-단백질 항원(또는 에피톱) 복합체를 이용한 면역반응조절 효능은 감염질환 및 암등과 같은 난치성 질환 예방 및 치료를 위한 백신 및 치료용 항체 개발에 유용하게 이용할 수 있을 것임. Phosphodiester bond의 CpG-DNA 및 CpT motif의 SACT4501 면역조절물질들이 리포좀에 encapsulation 되었을 때 인간의 면역세포 활성화를 조절하는 특성을 이용하여 면역보조제 뿐 만 아니라 아토피 피부염 치료제, 암과 같은 난치성 질환의 치료, 알러지성 면역질환인 천식, 알러지성 비염 등의 원인이 되는 Th1/Th2 면역반응의 불균형을 조절하여 다양한 면역질환 치료에 응용될 수 있을 것으로 판단됨.
3) Innate immunity의 가장 중요한 세포인 macrophage 와 microglia 의 사멸과 기능 특히 TLR 및 non-TLR ligand 에 의한 macrophage tolerance 및 non-macrophage innate immunity 에 대한 기전 및 조절이 규명되고, 이를 이용한 당뇨병 치료법이 개발되어 innate immunity, adaptive immunity, 염증 반응을 조절하여 각종 면역 질환 및 비면역질환에 대하여 임상적 응용에 이르는 새로운 방법이 개발하는데 활용할 예정임
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원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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