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보고서 요약서(보고서 초록)
요약문
SUMMARY
CONTENTS
목차
제1장 연구개발과제의 개요 11
제1절 연구개발의 필요성 11
제2절 연구개발의 목표 12
제3절 연구개발의 범위 12
제2장 국내외 기술개발 현황 14
제1절 국내·외 배양기술에 대한 개발현황 14
1. 미생물 생산화 배양기술 현황 14
2. 기존의 배양 기술 및 시스템의 차별성 14
3. 배양연구를 위한 초기특허분석 15
제2절 미국의 β-Carotene의 원료의약품(API) 시험검사기준 16
1. The United States Pharmacopeial Convention(USP)의 β-carotene정제검사 기준 16
2. 기존의 β-carotene과 9-cis β-carotene의 생산 및 성질의 차별성 17
제3절 미국 특허법령변경 고시내용(천연물 및 천연물의약품) 18
1. 자연 / 자연원리, 자연 현상, 및 자연제품 법률의 변경 고시 19
2. 분리 정제된 천연물, 정제된 천연물 이성질체, 정제된 천연물의 임상용도의 사용에 따른 변경고시 19
제3장 연구개발 수행 내용 및 결과 22
제1절 공압 광 생물 반응시스템을 파일롯 보완설계 및 제작 22
1. 측정부분에 설계보완 22
2. 본체, 보조탱크, 배관, 계이지 및 센서 부착 23
2. 배양기 연결배관흐름도 23
3. 필터링 시스템의 설계 및 제작 25
제2절 미세조류 배양속도 향상을 위한 환경조성 시험 및 연구 25
제3절 해양박테리아의 초기배양 환경연구 33
1. 색소 최적 생성 조건 실험 33
2. 안정성 실험 - 빛, 금속이온, 온도, 항균활성 33
3. 137WSW15(Pseudoalteromonas piscicida)의 최적색소 형성실험 및 안정성검사 34
4. 141GS2-1(Erythrobacter gangjinensis)의 최적색소 형성실험 및 안정성검사 36
5. 141GS2-8(Erythrobacter aquimaris)의 최적색소 형성실험 및 안정성검사 38
6. 137WSW15(Pseudoalteromonas piscicida)의 최적색소 형성실험 및 안정성검사 40
제4절 9-cis β-carotene의 분리 및 정제연구 및 개발 43
1. 초기 배양액의 건조 및 초기 정제에 필요한 공정 43
2. 오픈칼럼 크로마토그래피를 통한 9-cis β-carotene의 분리 43
3. ODS open column에서의 9-cis β-carotene separation 44
4. 9-cis β-carotene의 결정화 45
5. 9-cis β-carotene의 Membrane Test 45
6. 9-cis β-carotene의 순도검사 45
제5절 9-cis β-carotene생산을 위한 초기 Validation 47
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 48
제1절 연구목표 및 평가착안점에 입각한 연구개발목표의 달성도 48
1. 연구개발의 최종목표 48
2. 연구개발의 세부목표 48
제2절 기술발전에의 기여도 및 파급효과 48
1. 기술적 측면의 파급효과 48
2. 경제적·산업적 측면의 파급효과 48
제5장 연구개발결과의 활용계획 50
제1절 추가연구의 필요성 50
제2절 추가연구의 방향 50
1. Description 50
2. Synthesis 51
3. Application 52
4. Clinical Example 52
제3절 9-cis β-carotene생산을 위한 기업화 추진방안 54
1. 명학일반산업단지 공장설립 계획 54
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 56
제1절 USP REFERENCE STANDARDS 56
1. TYPES OF REFERENCE STANDARDS 56
2. Impurity Reference Standards 56
3. APPLICATIONS OF USP REFERENCE STANDARDS 58
4. PACKAGING 58
5. LABELING 59
6. PROPER USE 59
7. STORAGE 60
제7장 연구시설·장비 현황 61
제8장 참고문헌 62
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I. 제목 :
항산화성 조류 듀나리엘라(Dunaliella)로부터 치료용 카로티노이드(Carotenoid) ; 고용량 비타민류 성분의 분리정제 [특허 ; 해양미세 조류 및 박테리아의 속도향상 배양 시스템 및 이로부터의 9-cis β-carotene의 분리 및 정제방법]
II. 연구개발의 배경 및 필요성
1980년대 이후, β-carotene은 항암 또는 항산화 약으로 유용할 것으로 예상되어 왔다. 최근서는 β-carotene의 기하학적 이성질체의 효과에 많은 관심초점을 맞추고 있으며, 9-cis β-carotene은 암(Cancer), 심혈관질환 (CVD : Cardinal visual disease), 뇌혈관질환(MI : Myocardial Infarction)에 임상의약품(IND : Investigational New Drug)의 임상에 활용되고 있다.
본 연구는 의약용으로 가능한 β-carotene의 이성질체 중, 세포 및 동물실험 이후의 단계인 임상연구로 확인된 이성질체가 9-cis 것에 관한 것으로, 해양미생물을 보다 효율적으로 배양하고, 이 중 카로티노이드 성분을 확인 및 검사하여 9-cis β-carotene의 분리정제 연구를 통하여, 국내 및 해외의 생산기준에 맞는 생산의 Validation을 초기 설계하는데 초점을 맞추고 있다.
III. 연구개발의 내용 및 범위
해양미생물배양을 위한 선정은 2014년 8월 한국의 경상남도 통영과 마산 인근에서 체취한 해양미생물 중 박테리아를 분리하고, 배양하고, 해양미세조류는 한국해양미세조류은행으로 분양받아 배양한 Dunaliella Salina [KMMCC-1064]를 선택하여 연구를 진행하였다.
해양박테이라는 Arthrobacter sp., Erythrobacter aquimaris, Erythrobacter gangjinensis, Microbacterium sp., Pseudoalteromonas piscicida, Microbulbifer epialgicus으로 판명되어지며, 상기 균주의 경우는 배양에 필요한 환경조건을 최적화 하는 연구의 목적으로 활용하기 위하여, pH, NaCl, 탄소원, 질소원, 빛, 온도, 금속이온, 향균활성의 변화를 주어 실험하였다. 또한 Dunaliella Salina는 기존의 배양방법을 참조하여 금속이온이 혼합되지 않은 F-2 배지를 조성하여, NaCl, 질소, 그리고 온도 및 빛의 변화를 주며, 배양속도 향상 실험을 진행하고, 총 카로티노이드 성분 및 유사 카로티노이드 성분을 분석하였다.
그리고, 이중 Dunaliella Salina의 경우 카로티노이드 중 원료의약품(API) 또는 임상의약품(IND)용 9-cis β-carotene의 Cyclo-hexanone 추출 및 오픈 컬름 크로마토그래피 추출법을 활용하여 분리정제법 개발하였으며, 배양 후, Hollow Fiber 멤브레인 필터를 이용한 Sludge의 분리방법 및 The United States Pharmacopeial Convention(USP)의 기준에 맞추어 β-carotene의 검사 0.45㎛에서의 통과 여부를 확인하고, 이보다 작은 0.40㎛에서의 9-cis β-carotene의 통과여부를 확인하고, NMR 검사를 통해 9-cis β-carotene분리 여부를 확인하였다. 또한 생산을 위한 초기 DMF Validation 설계하여 도식화 하였다.
IV. 연구개발결과
현재까지 진행된 상기의 해양미생물 중, 해양미세조류 Dunaliella Salina의 속도향상을 위한 조건은 HPLC를 통해 확인하였고, 그 결과 환경설정을 배앙시 16% NaCl 추가 + 2.5 mM/L Nitrogen의 환경을 설정한 군에서 치료용 카로티노이드가 가장 많이 발현되었음을 알 수 있었다, 총 생산된 카로티노이드의 생산량은 115.2 mg/g으로, 초기 메탈솔류션이 없이 조성한 F-2 배지의 카로티노이드 향량 9.2 mg/g보다 약 10배 이상 높음을 확인할 수 있었다.
해양 박테리아의 경우는 배양속도 향상에 필요한 질소원 탄소원의 비율에 대한 연구는 완료하였다. 결과론적으로는 배양은 약 15일을 기준으로 확인하였고, 최적의 배양시점은 4일이며, Spectrum Meter에서 카로티노이드 파장대 약 450 ~ 480nm에서 확인한 결과, Erythrobacter gangjinensis K7-2T의 경우 금속이온 MgC12의 첨가로 인한 배양의 경우 카로티노이드 함량향상이 약 15% 높았으며, Erythrobacter gangjinensis K7-2T와 Erythrobacter aquimaris SW-110T를 재외한 다른 대상균주의 경우 빛의 조사가 없는 암 배양의 경우에서 카로티노이드의 향상이 높음을 알 수 있었다. Microbacterium aquimaris JS54-2T균주의 경우 금속이온 CuC12에서 카로티노이드의 향상이 일반배지에서 보다 약 30%가량 높음을 확인할 수 있었다. 아직까지 진행 중에 있는 실험으로 결과의 서불리 단정할 수 없다. 또한 총 카로티노이드 함량 및 이로부터 얻을 수 있는 9-cis β-carotene의 분리정제에 관한 내용은 현재 진행 중에 있다.
또한 현재까지의 연구 및 실험결과 중 Dunaliella Salina로부터 9-cis β-carotene의 정제한 결과 총 추출률은 초기 Dunaliella Salina 건조 분말대비 결정된 9-cis β-carotene 7.5g을 건조 분말 1kg에서 얻을 수 있었다.
본 연구 및 개발을 통하여 USP의 β-carotene정제 및 검사대상 원료의약품으로 사용 및 허가에는 충족할 만한 결과를 얻었다. 또한 이성질체의 대한 NMR 검사는 완료되었다.
이후, 보다 자세하게는 합성물 9-cis β-carotene과의 비교 및 표준정제방법에 대한 국내외 식품의약품안전기준을 제시함으로 천연물유래 9-cis β-carotene정제 및 검사에 대한 최초의 사래로 인정됨과 동시에 원료의약품의 정제기준을 정립하고자 한다.
V. 연구개발결과의 활용계획
해양 박태리아는 환경조성 연구를 마무리하여, 보다 효율적인 카로티노이드 생산에 적용하고자 하며, Dunaliella Snlina보다 배양기간이 매우 단축할 수 있어, 해양 미세조류에서의 카로티노이드 생산과 비교할 가치가 충분하다. 따라서 2014년 12월을 본 배양연구완료를 목표로 하고 있다.
해양 미세조류인 Dunaliella Salina를 통한 9-cis β-carotene의 정제방법은 표준정제법을 국내외 식품의약품안전관리 기관에 인증을 받기위하여, 특허 및 추가검사를 진행하고자 한다. 또한 지금까지 연구되어진 초기 DMF Validation을 실질 공정화 하고자, 현재 생산 Facility 구성을 준비하고 있으며, cGMP 시설을 갖춘 공정라인을 세종특별자치시 연동면 내판리 명학산업단지내 3,541 ㎥를 분양 받아 생산시설을 확충하고자 시설설계 중에 있다.
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원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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