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표제지
목차
요약문 3
Ⅰ. 서론 9
Ⅱ. 연구내용 및 방법 14
1. 연구내용 14
가. 면역학적 방법을 이용하여 노로바이러스의 신속진단을 위한 rVLP 제작 및 이를 이용한 특이성 연구 14
나. 분자생물학적방법 (hybridization)을 이용한 노로바이러스의 특이적 유전자 probe 조사 및 연구 14
다. 면역학적 방법과 분자생물학적 방법의 이용가능성 및 신속진단 키트의 적용가능성 평가 14
2. 연구방법 14
나. 분자생물학적 방법 (hybridization)을 이용한 노로바이러스의 특이적 유전자 probe 조사 및 연구 17
다. 면역학적 방법과 분자생물학적 방법의 이용가능성 및 신속진단 키트의 적용가능성 평가 19
3. 연구 추진체계 21
Ⅲ. 연구결과 및 고찰 23
1. 면역학적 방법을 이용하여 노로바이러스의 신속진단을 위한 rVLP 제작 및 이를 이용한 특이성 연구 23
가. 베큘로바이러스를 reporter gene으로서 EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) 발현 조사 (2013년도 연구 결과) 23
나. 노로바이러스 VP1, VP2 region의 epitope 유전자 확보 및 유전자의 베큘로바이러스 시스템 적용 평가 (2013년도 연구결과) 24
다. Major capside protein을 coding 하고 있는 VP1(ORF2)의 발현, 정제 및 rVLP의 항원으로서의 가능성 확인 (2014년도 연구결과) 28
2. 분자생물학적 방법 (hybridization)을 이용한 노로바이러스의 특이적 유전자 probe 조사 및 연구 38
가. Probe 디자인을 위한 염기서열 분석 38
나. 임상샘플에서의 hybridization 방법에 의한 검출 43
Ⅳ. 결론 44
1. 면역학적 방법을 이용하여 노로바이러스의 신속진단을 위한 rVLP 제작 및 이를 이용한 특이성 연구 44
(1) 형광유전자인 EGFP 유전자를 이용하여 재조합 베큘로바이러스의 발현성 조사 44
(2) 국내에서 유행한 노로바이러스 capside유전자를 이용하여 rVLP 제작 45
(3) rVLP의 순수 분리주 및 고역가 바이러스 확보 및 rVLP 형성 확인 45
(4) 실험동물을 이용한 단일 또는 다클론 항체형성 조사 및 신속진단 키트로서의 가능성 평가 45
2. 분자생물학적 방법 (hybridization)을 이용한 노로바이러스의 특이적 유전자 probe 조사 및 연구 46
(1) 노로바이러스 genotype에 따른 특이적 유전자 probe 설정 46
(2) Hybridization 방법을 이용한 노로바이러스 진단조건 확립 및 dot blot 방법을 이용한 효율검증 46
3. 면역학적 방법과 분자생물학적 방법의 이용가능성 및 신속진단 키트의 적용가능성 평가 47
Ⅴ. 기대성과 48
참고문헌 49
Table 1. Immunization schedule 31
Table 2. 1st Bleeding ELISA test 32
Table 3. 2nd Bleeding ELISA test 33
Table 4. Norovirus GⅠ, GⅡ Probe design 40
Fig 1. Organization of the Norovirus 10
Fig 2. Norovirus structure protein 11
Fig 3. Food poisoning occurrence during 2002~2013 in South Korea 13
Fig 4. Baculovirus Expression Vector System 16
Fig 5. Verification of VP1(ORF2) gene expression by Western Blotting 17
Fig 6. Probe design 17
Fig 7. Membrane blotting diagram 19
Fig 8. Comparison of sensitivity to detect of Norovirus RNA by RT-PCR and Real time PCR 20
Fig 9. BEVS-EGFP expression system 23
Fig 10. Confirmation of the BEVS-EGFP expression system by EGFP 24
Fig 11. Sequences of Norovirus VP1 and VP2 regions 25
Fig 12. Verification of VP1 and VP2 gene in shuttle vector by PCR 26
Fig 13. Schematic diagram for recombinant Baculovirus propagation containing Norovirus VP1 and VP2 genes 26
Fig 14. Schematic diagram for rVLP propagation using recombinant Baculovirus expression system and confirmation of VP1 and VP2 proteins expression by Western Blotting method 28
Fig 15. Expression of ORF2, verification by Western Blotting 29
Fig 16. Verification by Coomassie blue staining and Western Blotting 30
Fig 17. Verification of concentrated rVLP by coomassie blue staining and Western Blotting 30
Fig 18. 1st Bleeding ELISA test 32
Fig 19. 2nd Bleeding ELISA test 33
Fig 20. Anti rVLP antibody sensitivity test 34
Fig 21. Human Norovirus detection by RT-PCR 35
Fig 22. Anti rVLP antibody ELISA test with human Norovirus stool sample 36
Fig 23. Commercial Norovirus detection kit test 37
Fig 24. Norovirus GⅠ sequence analysis using Meg-align program 38
Fig 25. Norovirus GⅡ sequence analysis using Meg-align program 39
Fig 26. Probe design using Oligo 6 program 40
Fig 27. GⅠ, GⅡ probe specificity test 41
Fig 28. GⅠ, GⅡ probe sensitivity test 42
Fig 29. Human norovirus GⅠ, GⅡ hybridization test with designed probe 43
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