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표제지
제출문
목차
제1장 서론 10
제2장 토양 미생물 군집에 의한 분해 및 생태분석을 위한 MBT 11
제1절 토양 시료 채취 방법 11
1. 시료 채취 11
제2절 DNA 추출방법 13
1. DNA kit 선정 13
2. DNA 추출 방법 14
제3절 RNA 추출 방법 17
1. RNA kit 선정 17
2. RNA 추출 방법 19
3. cDNA 합성 방법 24
제4절 미생물 군집 분석을 위한 T-RFLP 방법 26
1. T-RFLP 원리 26
2. 16s rRNA 유전자 T-RFLP 26
3. 분해 유전자 T-RFLP 36
제5절 미생물 정량측정을 위한 qPCR 방법 44
1. qPCR 원리 44
2. qPCR 준비 단계 45
3. qPCR 분석 단계 48
제6절 미생물 군집 분석을 위한 Pyrosequencing 방법 49
1. Pyrosequencing 준비 단계 49
2. Pyrosequencing 중 고려사항 63
3. Pyrosequencing 된 염기서열 분석 단계 65
4. 미생물 군집 분석 72
제7절 미생물군집 및 활성유전자 분석을 위한 Metagenome 방법 92
1. Metagenome 분석 툴의 종류 92
2. Metagenome 분석 과정 95
제3장 미생물에 의한 오염물질 분해특성 측정 및 분석 100
제1절 주요오염물질 분해특성 개요 100
1. 유류 : Gasoline, TPH (Total Petroleum Hydrocarbons) 100
2. 염소화유기용제 : PCE/TCE 101
제2절 분해속도 측정방법 103
1. 유류 : Gasoline, TPH (Total Petroleum Hydrocarbons) 103
2. 염소화유기물질 : PCE/TCE 및 중간생성물 측정 방법 111
제4장 토착미생물에 의한 자연저감 진단 및 생물학적 공법 선정 지원 113
제1절 지침의 범위 113
제2절 유류오염의 토착미생물에 의한 분해능력 진단 기반의 생물학적 공법 선정 114
1. 개요 114
2. 토착미생물 군집 특성으로 유류오염 분해 속도 산정 114
3. 정화 목표 달성에 필요한 토착 미생물 량(X) 추정 116
4. 토착 미생물 생태학적 특성을 활용한 유류오염 토양의 생물학적 정화공법 선정 124
제3절 염소화 유기물질의 지하수내 미생물에 의한 분해능력 진단과 생물학적 공법 선정 126
1. 개요 126
2. 토착 미생물 군집 특성으로 염소화 유기용제 분해 속도 산정 127
3. 정화 목표 달성에 필요한 토착 분해 미생물 양(X) 추정 128
4. 토착 미생물 생태학적 특성 활용한 염소화 유기용제 지하수 생물학적 정화공법 선정 130
제4절 Bioaugmentation 공법 선정시 최적화 지침 131
1. Dehalococcoides 컨소시엄미생물 제재의 대량배양 및 QC 관리 131
2. 유류오염 Bioaugmentation의 미생물 제재 투여량과 배양량 설계 지침 132
제5장 참고문헌 135
〈표 2-1〉 DNA 추출 Kit 비교 분석 결과 13
〈표 2-2〉 RNA 추출 Kit 비교 17
〈표 2-3〉 여러 가지 RNA 추출 Kit를 이용한 토양 유형별 RT-PCR 결과 18
〈표 2-4〉 기존 연구에 사용된 다양한 조건 27
〈표 2-5〉 분해 유전자 primer 37
〈표 2-6〉 본 연구에서 사용한 qPCR 용 primer set 46
〈표 2-7〉 Master mix 조성 47
〈표 2-8〉 대조용 template 제작 47
〈표 2-9〉 박테리아 Pyrosequencing용 Adptor-Key-Barcode-Linker-Primer 목록 (5->3 방향) 50
〈표 2-10〉 PCR 반응액 내 화학적 조성 53
〈표 2-11〉 박테리아 V4-V5 부위 PCR 증폭 조건 54
〈표 2-12〉 아가로오스 농도에 따른 DNA 단편의 분리범위 55
〈표 2-13〉 TAE와 TBE 조성 55
〈표 2-14〉 PCR 증폭 산물의 농도와 크기를 고려한 적정 주입 부피 계산 예시 62
〈표 3-1〉 토양오염 우려기준 및 대책기준 100
〈표 3-2〉 TPH 및 BTEX 성질 101
〈표 3-3〉 Toluene 분해능 실험을 위한 media 조성 및 농도 103
〈표 3-4〉 Toluene의 headspace-GC/FID 분석조건 105
〈표 3-5〉 경유(Diesel) 분해능 실험을 위한 media 조성 및 농도 106
〈표 3-6〉 PCE/TCE headspace-GC/FID 분석조건 112
〈표 4-1〉 SDR 예측에 적용할 수 있는 독립변수 (미생물 생태특성 인자) 값들의 범위 115
〈표 4-2〉 초기 가솔린 오염농도 (S0) 와 다양한 토양 미생물 군집 특성 별로 목표 정화 기간 (t)...(이미지참조) 119
〈표 4-3〉 초기 디젤 오염농도 (S0) 와 다양한 토양 미생물 군집 특성 별로 목표 정화 기간 (t)내...(이미지참조) 120
〈표 4-4〉 유류오염 내 BTEX 복합오염의 Km 값(이미지참조) 121
〈표 4-5〉 토양 유류오염의 aging이 분해속도에 미치는 영향에 대한 문헌자료 123
〈표 4-6〉 생태학적 인자를 활용한 유류오염 토양의 생물학적 정화공법 선정을 위한 기준 설정 125
〈표 4-7〉 탈염소화 가능 박테리아 염기서열 유사성 기반 계통학적 그룹 별 Vmax, km 값 지침(이미지참조) 127
〈표 4-8〉 생태학적 인자를 활용한 염소화 유기용제 지하수 오염의 생물학적 정화공법 선정 지침 130
〈표 4-9〉 혐기성 PCE 분해 및 무해화를 위한 최적화 조건 131
〈그림 2-1〉 토양시료 채취지점도 11
〈그림 2-2〉 토양시료채취기 및 코어샘플러 예시 12
〈그림 2-3〉 T-RFLP 분석 순서도 26
〈그림 2-4〉 Restriction enzyme별 분석 결과 27
〈그림 2-5〉 SYBR Green method를 이용한 10X serial diluted DNA의 정량 44
〈그림 2-6〉 SYBR Green 방법을 통한 qPCR 개요 44
〈그림 2-7〉 Taqman probe 방법을 이용한 qPCR 개요 45
〈그림 2-8〉 qPCR standard curve (좌)와 melting curve (우) 48
〈그림 2-9〉 qPCR 결과 분석 48
〈그림 2-10〉 High fidelity Taq polymerase (AccuPrime)와 일반 Taq polymerase의 비교 51
〈그림 2-11〉 PCR 개요도 52
〈그림 2-12〉 Emulsion PCR 과정 64
〈그림 2-13〉 Pyrosequencing Library quality control 결과 예시 65
〈그림 2-14〉 Mothur 소프트웨어 다운로드 66
〈그림 2-15〉 Mothur 소프트웨어 기본 양식 67
〈그림 2-16〉 tag 파일 형식 68
〈그림 2-17〉 RDP database 73
〈그림 2-18〉 RDP Pipeline 로그인 73
〈그림 2-19〉 RDP Pipeline 접속화면 74
〈그림 2-20〉 Align 작업화면 75
〈그림 2-21〉 Align 결과 확인 75
〈그림 2-22〉 Cluster 작업화면 76
〈그림 2-23〉 Clustering 결과 확인 77
〈그림 2-24〉 Representative sequence 작업화면 78
〈그림 2-25〉 Representative sequence 결과 확인 79
〈그림 2-26〉 미생물 군집 분석 절차 79
〈그림 2-27〉 Shannon index and Chao1 작업화면 80
〈그림 2-28〉 Shannon index and Chao1 결과 확인 81
〈그림 2-29〉 Rarefaction 작업화면 81
〈그림 2-30〉 Rarefaction 결과 확인 82
〈그림 2-31〉 Rarefaction curve 결과 82
〈그림 2-32〉 Sequence selection 작업화면 83
〈그림 2-33〉 Sequence selection 결과 확인 84
〈그림 2-34〉 Cluster file formatter 작업화면 85
〈그림 2-35〉 Cluster file formatter 결과 확인 85
〈그림 2-36〉 Classifier 작업화면 86
〈그림 2-37〉 Classifier 결과 확인 87
〈그림 2-38〉 미생물 개체 군집 구성 분석 88
〈그림 2-39〉 염기서열 정보 추출 화면 90
〈그림 2-40〉 BLAST 접속화면 90
〈그림 2-41〉 BLAST 작업화면 91
〈그림 2-42〉 BLAST 결과 확인 91
〈그림 2-43〉 EGAN을 이용한 metagenome 분석 개요 92
〈그림 2-44〉 IMG/M을 이용한 metagenome 분석 개요 93
〈그림 2-45〉 CAMERA를 이용한 metagenome 분석 개요 93
〈그림 2-46〉 MG-RAST의 metagenome 분석 개요 94
〈그림 3-1〉 PCE 분해경로 및 무해화 순서 102
〈그림 3-2〉 테트라클로로에틸렌(PCE) 분해 혐기성 미생물 제재 JL-1 획득 개요도 111
〈그림 4-1〉 유류 오염의 토착미생물에 의한 자연저감 진단과 생물학적 공법 선정 흐름도 114
〈그림 4-2〉 오염물질과 분자생태학적 특성 인자에 따른 SDR 상관식 115
〈그림 4-3〉 정화 목표 달성에 필요한 토착 미생물의 양(X) 추정하는 방법 117
〈그림 4-4〉 목표 처리 시간내 목표 정화 농도 만족을 위한 토착 미생물 량(X) 추론 프로그램 117
〈그림 4-5〉 다양한 토양 미생물 군집 특성과 초기 오염농도 (So) 별로 목표 정화 기간 (t)내... 118
〈그림 4-6〉 가솔린 복합오염의 영향을 고려한 정화목표 달성에 필요한 토착 미생물 량(X) 추정 알고리즘 122
〈그림 4-7〉 디젤 복합오염의 영향을 고려한 정화목표 달성에 필요한 토착 미생물 량(X) 추정 알고리즘 122
〈그림 4-8〉 생태학적 인자를 활용한 유류오염 토양의 생물학적 정화공법 선정 지원 논리 124
〈그림 4-9〉 염소화 유기용제오염의 토착미생물에 의한 자연저감 진단과... 126
〈그림 4-10〉 박테리아 16S rRNA군집 조성에서 탈염소화가능 박테리아 동정 127
〈그림 4-11〉 목표 처리 시간 내 목표 정화 농도 만족을 위한 토착 미생물 량(X) 추정 알고리즘 128
〈그림 4-12〉 유류오염 Ex-situ bioaugmentation 최적화 지원을 위한 모듈 개발 132
〈그림 4-13〉 유류오염 토양의 미생물 제재 투여시 활용할 수 있는 SDR 산정식 133
〈그림 4-14〉 유류 오염 토양의 16S rRNA gene Evenness별 투입 필요 미생물 양(ΔX)... 133
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