표제지

목차

Ⅰ. 식중독의 정의 5

1. 식중독의 정의 6

2. 식중독의 분류 6

2-1. 미생물학적 식중독의 분류 6

2-2. 화학물질에 의한 식중독의 분류 7

3. 식중독의 종류 7

3-1. 미생물학적 식중독 7

3-2. 화학적 식중독 40

Ⅱ. 시험원칙 45

1. 식중독 원인조사 시험원칙 46

2. 식중독 원인조사 주의사항 47

Ⅲ. 식중독 원인조사 이동차량 시험법 48

1. 실시간 유전자 증폭장치(Real-time PCR) 49

1-1. 원리 49

1-2. 시약 및 초자 50

2. 위해 미생물 분석 53

2-1. 업무 Flow Chart 53

2-2. Step 1 유전자 추출 53

2-3. Step 2 : 유전자 증폭 58

2-4. Step 3 : 분석결과 확인 68

2-5. Step 4 : 식품시료에 적용 68

2-6. Step 5 : 배양 및 이동 69

2-7. Step 6 : 확인시힘 69

Ⅳ. 식중독균 시험법 70

1. 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 72

1-1. PCR에 의한 유전자 확인법 72

1-2. Real-time PCR에 의한 유전자 확인법 76

1-3. Fast Real-time PCR에 의한 유전자 확인법 78

1-4. 식품공전 시험법(황색포도상구균) 80

2. 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 84

2-1. PCR을 사용한 유전자 확인법 84

2-2. Real-time PCR에 의한 유전자 확인법 86

2-3. 식품공전 시험법(리스테리아 모노사이토제네스) 89

3. 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus) 95

3-1. PCR에 의한 독소 유전자 확인법 95

3-2. Real-time PCR에 의한 유전자 확인법 97

3-3. 식품공전 시험법(바실러스 세레우스) 100

4. 살모넬라 (Salmonella spp.) 104

4-1. PCR에 의한 유전자 확인법 104

4-2. Real-time PCR에 의한 유전자 확인법 107

4-3. Fast Real-time PCR에 의한 유전자 확인법 109

4-4. 식품공전 시험법(살모넬라) 111

5. 장염비브리오 (Vibrio parahaemolyticus) 118

5-1. PCR을 사용한 유전자 확인법 118

5-2. Real-time PCR에 의한 유전자 확인법 122

5-3. Fast Real-time PCR에 의한 유전자 확인법 124

5-4. 식품공전 시험법(장염비브리오) 126

6. 캠필로박터 제주니/콜리 (Gampylobacter jejuni/coli) 129

6-1. PCR에 의한 유전자 확인법 129

6-2. Real time PCR 유전자 확인법 130

6-3. 식품공전 시험법(캠필로박터 제주니/콜리) 133

7. 클로스트리 디움 퍼프린젠스 (Closttidium perfringens) 136

7-1. PCR에 의한 유전자 확인법 136

7-2. Real time PCR에 의한 유전자 확인법 139

7-3. Fast Real-time PCR에 의한 유전자 확인법 140

7-4. 식품공전 시험법(클로스트리디움 퍼프린젠스) 143

8. 여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica) 146

8-1. PCR에 의한 유전자 확인법 146

8-2. Real time PCR에 의한 유전자 확인법 148

8-3. 식품공전 시험법(여시니아 엔테로콜리티카) 153

9. 병원성 대장균 (Pathogenic Escherichia coli) 155

10. 쉬겔라 (Shigella spp.) 166

10-1. 증균배양 166

10-2. 분리배양 166

10-3. 확인시험 167

10-4. PCR에 의한 유전자 확인법 167

10-5. Real-time PCR에 의한 유전자 확인법 169

10-6. 혈청학적 시험 170

11. 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera) 171

11-1. 증균배양 171

11-2. 분리배양 171

11-3. 확인시험 171

11-4. PCR에 의한 유전자 확인법 172

11-5. Real-time PCR에 의한 유전자 확인법 174

12. 비브리오 불니피쿠스 (Vibrio vulnificus) 177

12-1. 증균배양 177

12-2. 분리배양 177

12-3. 확인시험 177

12-4. PCR어| 의한 유전자 확인법 178

12-5. Real-time PCR에 의한 유전자 확인법 180

12-6. Fast real-time PCR에 의한 유전자 확인법 181

13. 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium otulinum) 186

13-1. 증균배양 186

13-2. 분리배양 186

13-3. 확인시험 186

13-4. 독소확인시험 187

13-5. PCR 확인시험 187

Ⅴ. 식중독 바이러스 시험법 191

1. 검체별 전처리 방법 193

1-1. 식품용소 시험법 193

1-2. 어패류(굴) 시험법 198

1-3. 채소류,과일류,절임식품 시험법 201

1-4. 김치류 시험법 205

1-5. 식육 시험법 206

2. 유전자 추출법 209

2-1. 유전자 추출법(공통적용) 209

3. 유전자 증폭법 211

3-1. 노로바이러스 (Norovirus) 211

3-2. A형 간염바이러스 (Hepatitis A virus) 217

3-3. 로타바이러스 (Rotavirus) 222

3-4. 아스트로바이러스 (Astrovirus) 228

3-5. 장관아데노바이러스 (Enteric Adenovirus) 232

3-6. 사포바이러스 (Sapovirus) 235

3-7. E형 간염바이러스 (Hepatitis E virus) 239

Ⅵ. 식중독 원충 시험법 245

1. 작은와포자충 (Cryptosporidium parvum) 246

2. 람블편모충 (Giardia lamblia) 267

3. 이질아메바 (Entamoeba histolytica) 280

4. 원포자충 (Cydospora cayetanesis) 292

5. 쿠도아 (Kudoa septempunctata) 317

5-1. 시험법 317

5-2. 판정방법 324

[참고] 톡소포자충 (Toxoplasma gondii) 326

판권기 332

3-1. 노로바이러스 (Norovirus) 211

표 1. 노로바이러스 Duplex Realtime RT -PCR 211

표 2. 노로바이러스 Duplex Real-time RT -PCR의 표라이머와 표로브의 염기서열 212

표 3/표 1. 노로바이러스 One-slep RT -PCR 반응액 조성 213

표 4/표 2. 노로바이러스 One-slep RT -PCR 반응조건 및 온도 213

표 5/표 3. 노로바이러스 Semi-nested PCR 반응액 조성 214

표 6/표 4. 노로바이러스 Semi-nested PCR 반응조건 및 온도 214

표 7/표 5. 노로바이러스 PCR 표라이머 염기서열 215

표 8/표 6. 노로바이러스 PCR 결과판정 (예시) 216

3-2. A형 간염바이러스 (Hepatitis A virus) 218

표 1. A형 간염 바이러스의 Realtime one-step RT-PCR 조성 218

표 2. A형 간염바이러스 Realtime one-step RT -PCR 프라이머와 프로브의 염기서열 218

표 3/표 1. A형 간염바이러스 One-slep RT -PCR 반응액 조성 219

표 4/표 2. A형 간염바이러스 One-slep RT -PCR 반응조건 및 온도 219

표 5/표 3. A형 간염바이러스 nested PCR 반응액 조성 220

표 6/표 4. A형 간염바이러스 nested PCR 반응 조건 및 온도 220

표 7/표 5. A형 간염바이러스 프라이머 염기서열 221

표 8/표 6. A형 간염바이러스 PCR 결과 확인 221

3-3. 로타바이러스 (Rotavirus) 223

표 1. 로타바이러스 Realtime RT-PCR 조성 223

표 2. 로타바이러스 Duplex Realtime RT-PCR의 표라이머와 표로브의 염기서열 223

표 3/표 1. 로타바이러스 One-step RT -PCR 반응액 조성 224

표 4/표 2. 로타바이러스 One-step RT -PCR 반응조건 및 온도 224

표 5/표 3. 로타바이러스 Semi-nested PCR 반응액 조성 225

표 6/표 4. 로타바이러스 Semi-nested PCR 반응 조건 및 온도 226

표 7/표 5. 로타바이러스 표라이머 염기서열 226

표 8/표 6. 로타바이러스 PCR 결과 확인 227

3-4. 아스트로바이러스 (Astrovirus) 228

표 1. 아스트로바이러스의 Realtime RT-PCR 조성 228

표 2. 아스트로바이러스 Realtime RT -PCR 프라이머와 프로브의 염기서열 229

표 3. 아스트로바이러스 One-step RT -PCR 반응액 조성 229

표 4. 아스트로바이러스 One-step RT -PCR 반응조건 및 온도 230

표 5. 아스트로바이러스 표라이머 염기서열 230

표 6. 아스트로바이러스 PCR 결과 확인 231

3-5. 장관아데노바이러스 (Enteric Adenovirus) 232

표 1. 장관아데노바이러스 Realtime PCR 조성 232

표 2. 장관아데노바이러스 Duplex Realtime RT -PCR의 표라이머와 표로브의 염기서열 233

표 3/표 1. 장관아데노바이러스 PCR 반응액 조성 233

표 4/표 2. 장관아데노바이러스 PCR 반응조건 및 온도 234

표 5/표 3. 장관아데노바이러스 표라이머 염기서열 234

표 6/표 4. 장관아데노바이러스 PCR 결과 확인 235

3-6. 사포바이러스 (Sapovirus) 236

표 1. 사포바이러스 1 차 PCR 반응액 조성 236

표 2. 사포바이러스 1 차 PCR 반응조건 및 온도 236

표 3. 사포바이러스 2차 PCR PCR 반응액 조성 236

표 4. 사포바이러스 PCR 반응조건 및 온도 237

표 5. 사포바이러스 3차 PCR 반응액 조성 237

표 6. 사포바이러스 3차 PCR 반응조건 및 온도 237

표 7. 사포바이러스 표라이머 염기서열 238

표 8. 사포바이러스 PCR 결과 확인 239

3-7. E형 간염바이러스 (Hepatitis E virus) 240

표 1. E형 간염바이러스 Realtime RT-PCR 조성 240

표 2. E형 간염바이러스 Realtime RT -PCR의 표라이머와 표로브의 염기서열 240

표 3. E형 간염바이러스 One-step RT -PCR 반응액 조성 241

표 4. E형 간염바이러스 One-step RT -PCR 반응조건 및 온도 242

표 5. E형 간염바이러스 Nested PCR 반응액 조성 242

표 6. E형 간염바이러스 Nested PCR 반응조건 및 온도 243

표 7. E형 간염바이러스 PCR 표라이머 염기서열 243

표 8. E형 간염바이러스 PCR 결과판정 (예시) 244

5. 쿠도아 (Kudoa septempunctata) 320

표 1. Real-time PCR 반응액 320

표 2. Real time PCR 반응조건 320

5. 장염비브리오 (Vibrio parahaemolyticus) 119

그림 1. V. parahaemolyticus에 특이적인 프라이머(toxR)를 이용한 PCR 결과 lane A : 음성대조군(no template), lane B : V. parahaemolyticus... 119

그림 2. V. parahaemolylicus에 특이적인 표라이머(Idh)를 이용한 PCR 결과 lane A : 음성대조군(no templatre), lane B : V. parahaemolyticus... 120

그림 3. V. parahaemolyticus에 특이적인 표라이머(trh)를 이용한 PCR 결과 lane A : 음성대조군(no templatre), lane B : V. parahaemolyticus... 122

7. 클로스트리 디움 퍼프린젠스 (Closttidium perfringens) 137

그림 1. C. pertringens에 특이적인 표라이머(cpe)를 이용한 PCR 결과. lane A : 음성대조군(no templatre), lane B : C. pertringens ATCC... 137

10. 쉬겔라 (Shigella spp.) 169

그림 1. Shigella 4종 및 기타 식중독균 multiplex PCR 반응 결과 169

11. 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera) 173

그림 1. Vibrio 5종 multiplex PCR 반응 결과 173

12. 비브리오 불니피쿠스 (Vibrio vulnificus) 179

그림 1. Vibrio 5종 multiplex PCR 반응 결과 179

13. 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium otulinum) 190

그림 1. Multiplex PCR detection of C. botulinum. Lanes: 1, molecular weight marker; 2, C botulinum type A; 3, C botulinum type B; 4, C. botulinum type E;... 190

1. 작은와포자충 (Cryptosporidium parvum) 246

그림 1. Millipore 여과 장치 및 filter membrane(0.22.μm filter) 246

그림 2. Orbital shaker 247

그림 3. 진공흡입장치(Vacuum suction) 247

그림 4. 지퍼백에 담은 채소류 248

그림 5. 세척액을 사용하여 세척중인 검체 248

그림 6. 세척용액을 원심 분리한 침전물 수거 과정 249

그림 7. 진공흡입장치를 사용하여 상층액을 제거하는 과정 249

그림 8. 50ml 튜브에 옮겨 원심분리된 침전물 250

그림 9. 진공흩입장치로 상층액 제거 후 원심 분리하여 생긴 침전물 250

그림 10. 채소류 세척 과정 251

그림 11. 지퍼백에 담은 채소류 251

그림 12. 지퍼백에 담은 과일류 252

그림 13. 토마토 쥬스의 건더기를 체에 거른 검체 252

그림 14. Dynabeads kit 내 포함되어 있는 시약 253

그림 15. 주사기를 사용하여 filter 할 수 있는 syringe filter 254

그림 16. Magnetic concentrator(MPC-S, MPC™-6와 L-10 tube) 254

그림 17. 샘플 회전 믹서 254

그림 18. magnetic particle concentrator(MPC)에 꽂혀진 샘플 255

그림 19. MPC에서 상층액 제거 후 tube 면에 부착된 bead 입자 256

그림 20. Zymo-Spin™ IV-HRC Column 258

그림 21. 슬라이드 도말 표본 261

그림 22. 건조된 슬라이드를 methanol 에 담가 heating plate에서 건조 과정 261

그림 23. Carbol fuchsin 염색 과정 261

그림 24. 3% acid alcohol 처리 후 세척 과정 262

그림 25. Methylene blue 염색 후 세척 과정 262

그림 26. 완성된 항산성 염색 표본 262

그림 27. 작은와포자충 난포낭(Bar, 10 um) 263

그림 28. 직접형광항체 염색 kit 263

그림 29. 형광염색용 슬라이드글라스와 humid chamber 264

그림 30. 커버글라스를 덮고 매니큐어를 칠하는 과정 265

그림 31. 작은와포자충 직접형광항체염색 사진 266

2. 람블편모충 (Giardia lamblia) 267

그림 1. Millipore 여과 장치 및 filter membrane(O.22μm filter) 267

그림 2. Orbital shaker 268

그림 3. 진공흡입장치 (Vacuum suction) 268

그림 4. 지퍼백에 담은 채소류 269

그림 5. 세척액을 사용하여 세척중인 검체 269

그림 6. 세척용액을 원심 분리한 침전물 수거 과정 270

그림 7. 진공흡입장치를 사용하여 상층액을 제거하는 과정 270

그림 8. 50ml 튜브에 옮겨 원심분리된 침전물 271

그림 9. 진공흡입장치로 상층액 제거 후 원심 분리하여 생긴 침전물 271

그림 10. 채소류 세척 과정 272

그림 11. 지퍼백에 담은 채소류 272

그림 12. 지퍼백에 담은 과일류 273

그림 13. 토마토 쥬스의 건더기를 체에 거른 검체 274

그림 14. Zymo-Spin™ IV-HRC Column 275

그림 15. 직접형광항체 염색 kit 277

그림 16. 형광염색용 슬라이드글라스와 humid chamber 278

그림 17. 커버글라스를 덮고 매니큐어를 칠하는 과정 279

그림 18. 람블편모충 직접형광항체염색 279

3. 이질아메바 (Entamoeba histolytica) 280

그림 1. Millipore 여과 장치 및 filter membrane(0.22.μm filter) 280

그림 2. Orbital shaker 281

그림 3. 진공흡입장치(Vacuum suction) 281

그림 4. 지퍼백에 담은 채소류 282

그림 5. 세척액을 사용하여 세척중인 검체 282

그림 6. 세척용액을 원심 분리한 침전물 수거 과정 283

그림 7. 진공흩입장치를 사용하여 상층액을 제거하는 과정 283

그림 8. 50ml 튜브에 옮겨 원심분리된 침전물 284

그림 9. 진공흡입장치로 상층액 제거 후 원심 분리하여 생긴 침전물 284

그림 10. 채소류 세척 과정 285

그림 11. 지퍼백에 담은 채소류 285

그림 12. 지퍼백에 담은 과일류 286

그림 13. 토마토 쥬스의 건더기를 체에 거른 검체 287

그림 14. Zymo-Spin™ IV-HRC Column 288

그림 15. 이질아메바의 포낭형(cyst). 요오드에 염색되어 노란색을 띠며 내부에 핵이 4개 관찰된다. 크기는 약 12 um 정도이다.(Bar, 20um) 291

4. 원포자충 (Cydospora cayetanesis) 292

그림 1. Millipore 여과 장치 및 filter membrane(0.22μm filter) 292

그림 2. Orbital shaker 293

그림 3. 진공흡입장치(Vacuum suction) 293

그림 4. 지퍼백에 담은 채소류 294

그림 5. 세척액을 사용하여 세척중인 검체 294

그림 6. 세척용액을 원심 분리한 침전물 수거 과정 295

그림 7. 진공흡입장치를 사용하여 상층액을 제거하는 과정 295

그림 8. 50ml 튜브에 옮겨 원심분리된 침전물 296

그림 9. 진공흡입장치로 상층액 제거 후 원심 분리하여 생긴 침전물 296

그림 10. 채소류 세척 과정 297

그림 11. 지퍼백에 담은 채소류 297

그림 12. 지퍼백에 담은 과일류 298

그림 13. 토마토 쥬스의 건더기를 체에 거른 검체 298

그림 14. Zymo-Spin™ IV-HRC Column 300

그림 15. 슬라이드 도말 표본 303

그림 16. 건조된 슬라이드를 methanol 에 담가 heating plate에서 건조 과정 303

그림 17. Carbol fuchsin 염색 과정 303

그림 18. 3% acid alcohol 처리 후 세척 과정 304

그림 19. Methylene blue 염색 후 세척 과정 304

그림 20. 완성된 항산성 염색 표본 304

그림 21. 항산성 염색된 원포자충. 305

그림 22. 형광현미경 305

그림 23. A: 자가형광을 띠는 원포자충 난포낭(약 8um) B: DIC 관찰 사진으로 내부 포자소체가 관첼 Bar, 10um) 306

[참고] 톡소포자충 (Toxoplasma gondii) 327

그림 1. 육류 샘플 DNA 추출 과정 (Bead 법) 327

그림 2. 표준곡선 330