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요약문
SUMMARY
Contents
목차
제1장 연구개발과제의 개요 8
제1절 연구개발 목적 8
1. 연구개발의 목적 8
2. 기대효과 8
제2절 연구개발의 필요성 9
1. 기술적 측면 10
2. 경제, 사회적 측면 11
3. 사회, 문화적 측면 13
제3절 연구개발 범위 13
가. 메타게놈 맞춤발현 호스트개발 13
나. 난발현 메타게놈 초고속 무세포발현 기술 13
다. 효소탐색 합성생물학기술 14
라. 통합적 HTS 연계를 위한 발현 및 탐색기술 14
제2장 국내외 기술개발 현황 15
제1절 국내·외 기술개발 현황 15
1. 메타게놈 자원 활용 기술 15
2. 메타게놈 발현 숙주-벡터 시스템 개발 16
3. 무세포 단백질 생산 기술 19
4. 메타게놈 유래 효소활성 검출 기술 21
제3장 연구 수행 내용 및 성과 25
제1절 메타게놈 고효율 발현 미생물 숙주 시스템 개발 25
1. 메타게놈 라이브러리 제작 효율 증대 25
2. 메타게놈 라이브러리 숙주의 유전체 발현 양상 분석 30
3. 메타게놈 발현 숙주 재설계 도구 개발 및 활용 47
제2절 메타게놈 유전자의 발현 효율 극대화 기술 개발 58
1. T7 RNA polymerase 발현 메타게놈 라이브러리 숙주 개발 58
2. PRI(Promoter random insertion) 활용 강제전사 기술 61
3. 유도성 메타게놈 발현 모듈을 기반으로 한 RPI(promoter random insertion) 64
4. 유도성 메타게놈 발현 모듈을 기반으로 한 PRI 발현 벡터 pBR322-dT7P 67
제3절 대장균 기반 무세포 단백질 시스템의 개량 72
1. 대장균 유래의 무 세포 단백질 생산 시스템의 생산성 및 경제성 향상 72
2. 대장균 자체 RNA 중합효소를 이용한 무세포 단백질 생산 시스템의 구축 75
제4절 비대장균 유래의 무세포 단백질 생산 시스템의 구축 79
1. 방선균 유래의 무세포 단백질 생산 시스템 79
2. 방선균 시스템을 이용한 phosphoglucomutase의 합성 및 활성 측정 80
3. 방선균 세포 파쇄액을 이용한 무세포 단백질 합성 시스템의 생산성 향상 81
4. 무세포 단백질 합성 시스템의 생산성을 위한 mRNA의 안정화 82
제5절 무세포 발현 시스템을 이용한 난발현 유전자 발현 84
1. 난발현 유전자의 효율적 발현 및 단백질의 용해도 증대 84
2. PCR template를 활용한 무세포 단백질 생산 시스템의 구축 92
제6절 극미량 효소활성 감지기술 개발 96
1. 메타게놈 유래 효소활성을 고감도로 감지하는 탐색기술개발 96
2. 메타게놈 유래 다양한 효소활성 감지 97
3. 배지 최적화를 통한 정량감도 및 리포터 신호수준 개선 98
4. 균체내 유전자회로 반응의 최적화를 통한 정량감도 개선 100
5. 형광 및 항생제내성단백질을 리포터로 사용하여 효소탐색기술의 HTS시스템 구축 102
제7절 활성감지 유전자회로 이용 메타게놈 탐색 신기술 104
1. 신규효소 발굴을 위한 HTS 적용기술 연구 104
2. 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii) 게놈 라이브러리에서의 TPL 유전자 탐색 106
3. 토양유래의 메타게놈 라이브러리에서의 알칼린 포스파타아제 탐색 108
4. 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase) 활성 유전자의 회수 및 분리 110
5. 신규 알칼린 포스파타아제의 특성연구 111
6. 신규 알칼린 포스파타아제의 DNA의 탈인산화 효과 116
제8절 무세포발현시스템-유전자회로 연계 기술 개발 118
1. 메타게놈 맞춤 호스트균주에서 유전자회로 적용기술 개발 118
2. 무세포발현시스템 연계 유전자회로기술 개발 119
제9절 메타게놈 유전자 강제 발현 벡터시스템 개발 121
1. Three frame expression 벡터 개발 122
2. Six frame expression 벡터 개발 126
제10절 메타게놈 라이브러리 구축 132
1. Fosmid를 이용한 soil metagenome library 제작 132
2. Plasmid를 이용한 soil metagenome library 제작 135
3. 대장균에서 Endo-beta-1,3-1,4 glucanase 유전자 발현 136
제11절 메타게놈 유전자 강제 발현 시스템 143
1. 메타게놈 유전자 고발현을 위한 강제전사 기술 개발 143
2. 강제전사(FT) 시스템을 메타게놈 용 포스미드 DNA에 랜덤 삽입 및 평가 144
3. 토양유래 메타게놈 라이브러리에 강제전사 시스템을 도입 146
4. 강제전사(FT) 시스템이 삽입된 FT-메타게놈 라이브러리에서 리파아제 탐색을 통한 강제전사 효과 검증 147
제12절 유전자회로 이용 분자진화 연구 및 산업용 효소 개량 검증 148
1. 유전자회로와 강제전사 시스템의 연계기술(FT-GESS)를 이용한 티로신페놀리아제의 탐색 148
2. 모델 효소를 이용한 산업용 효소 개량 시스템 확립 151
제13절 FT-GESS기술의 최적화 연구 155
1. FT-GESS 이용 메타게놈 맞춤형 탐색 균주 구축 155
2. FT-GESS기술에 적합한 메타게놈 유래 감지단백질(dmpR)의 발굴 및 개량 157
제14절 FT-GESS 연계기술의 적용을 위하여 메타게놈 유래 유용효소 탐색 161
1. 강제전사(FT) 시스템이 삽입된 토양유래 메타게놈 라이브러리에서 리파아제 탐색 161
2. 메타게놈 맞춤형 탐색균주에서 리파아제 기질에 대한 반응성 확인 162
3. 메타게놈 유래 신규 효소의 생화학적 특성분석 및 활용 164
4. 신규 효소의 특성 및 구조-기능 규명 166
제15절 효소의 활성부위 탐색을 위한 아미노산 scanning 기술 167
1. 단백질 내 아미노산 scanning을 위한 기술의 개요 167
2. 목적 유전자내 무작위 위치로 원하는 코돈(들)의 삽입 혹은 치환을 위한 유전자 조작법 168
3. 효소유전자 scanning을 위한 in-frame seIection과 원하는 코돈 서열의 치환 혹은 삽입이 가능한 vector의 개발 170
4. 무작위 치환 혹은 삽입이 가능한 목적 유전자 조작법 개발 171
제16절 유전자 혹은 리보조옴의 고정화 기술 개발 173
1. 유전자의 고정화와 이를 이용한 무세포 단백질 발현 173
2. 유전자의 고정화와 고정된 유전자로부터 무세포 단백질 발현 시스템을 통하여 발현된 목적 단백질의 고정화 기술 개발 174
제17절 변이된 효소 라이브러리의 초고속 발현 176
1. 목적 효소의 활성부위 탐색 및 무작위 변이된 유전자 라이브러리의 확보 176
2. HTS(high-thoroughput screening)시스템과 무세포 단백질 발현 시스템을 이용한 유전자 라이브러리의 발현 몇 활성 측정 177
제4장 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 179
제1절 연구개발목표의 달성도 179
1. 연구개발의 최종목표 179
2. 계획대비 달성도 179
제2절 관련 분야의 기술발전에의 기여도 182
제5장 연구개발성과의 활용계획 183
제6장 연구 과정에서 수집한 해외 과학기술 정보 186
제7장 연구개발성과의 보안등급 188
제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황 189
제9장 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전 조치 이행 실적 190
제10장 연구개발과제의 대표적 연구 실적 191
제11장 참고문헌 192
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원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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