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[표지]
보고서 요약서
국문 요약문
영문 요약문(SUMMARY)
목차
제1장 연구개발과제의 개요 6
1. 연구개발 목적 6
2. 연구개발의 필요성 6
1) 관상동맥 질환 환자의 증가 6
2) 관상동맥 질환 치료의 한계 6
3) 관상동맥질환의 새로운 세포치료기술 개발 필요 7
3. 연구개발 범위 7
제2장 국내외 기술 개발 현황 7
1. 국내외 수준 7
1) 혈관신생 치료법 7
2) 유전자 편집기술 8
2. 국내 연구현황 8
3. 국외 연구현황 8
제3장 연구 수행 내용 및 성과 9
1. 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 확보 및 배양법 확립 (줄기세포성 검증 확인) 9
1) Hedgehog signaling pathway를 activation 시킴으로써 줄기세포의 분화 억제를 통한 최적 배양 system 구축 9
2) 줄기세포의 이동 (mobilization)조절 신물질의 발굴 및 관련 기전 규명 10
2. 표적 세포의 host chromosome 내로 도입 가능한 두 종류의 혈관성장인자 HGF 혹은 VEGF 발현 10
1) HGF 혹은 VEGF inducible expression vector 제작 10
2) Inducible HGF 혹은 VEGF expression system에 의한 doxycycline에 의한 혈관성장유도인자들의 발현 조절 유무 확인 11
3. 유전자 조작기술인 TALENs을 이용한 혈관성장인자 VEGF를 분비하는 중간엽 줄기포주 구축 11
1) Host chromosome의 safe harbor site에 integration 된 inducible HGF 혹은 VEGF의 세포내외 발현 확인 11
2) VEGF 발현 중간엽 줄기세포로부터 분비된 VEGF의 양적확인 11
3) Inducible VEGF expression system이 integration 된 중간엽 줄기세포의 VEGF 발현에 의한 혈관 내피세포로의 잠재적 능력 평가 12
4) VEGF 발현 중간엽 줄기세포주의 동물생체 내 혈관유도능 검증 12
5) VEGF 발현 중간엽 줄기세포주가 이식된 생쥐에서의 Doxy에 의한 혈관형성유도인자의 발현 확인 13
6) 심근경색이 유발된 rat 동물모델에서의에서의 VEGF 발현 줄기세포주의 치료효과 규명 13
7) 심근경색이 유도된 rat에서의 향상된 심기능의 원인 규명 14
4. 유전자 조작기술인 TALENs을 이용한 혈관성장인자 HGF를 분비하는 중간엽 줄기포주 구축 14
1) HGF 발현 최적 줄기세포주의 선택 및 발현정도 확인과 세포별 transfection 효율 차이 비교 14
2) 줄기세포주 변경에 따른 HGF의 integration 확인 15
3) HGF 발현 중간엽 줄기세포주의 in vitro 내 migration 기능 검증 15
4) HGF 발현 주기세포주에서 장기적인 생물학적 효과 15
5) HGF 발현 중간엽 줄기세포주의 in vitro 내 혈관생성능력 검증 16
6) 하지허혈 동물모델에서 혈관생성능 검증 16
7) HGF 발현 중간엽 줄기세포주가 이식된 하지허혈모델에서 혈관인자 확인 17
5. 혈관성장인자와 줄기세포의 동반 적용에 대한 생체재료와의 기능검증 연구 18
1) 쥐 허혈성 하지모델에서 혈광형성유도인자와 후기내피전구세포가 함유된 microgel의 증가된 혈관 신생능 평가 18
2) 생체 내 RGD-알지네이트 마이크로젤에 포집된 후기내피전구세포 및 성장인자의 조합을 통해 향상된 혈관생성효과 실험 18
3) Rat 심근경색 모델에서의 질환극복을 위한 patch type의 cell sheet에 의한 중간엽 줄기세포의 증가된 치료효과 19
4) FN-Patch에서 배양된 중간엽 줄기세포의 조직학적 염색법을 통한 증가된 치료효과 규명 19
6. 후기내피전구세포 표면 특이적 바이오마커 발굴 조건 확립 및 proteogenomics 분석 20
1) 혈관내피세포로의 분화단계별 세포 확보 및 유전체와 단백체 분석을 위한 시료 확보 및 분석 조건 확립 20
7. 혈관내피전구세포에서 혈관내피세포로의 각 분화 단계별 세포의 단백체 분석 20
1) MACS sorting 후 선별된 OEC에서의 마커발현 확인 및 proteomics 기법을 이용한 막 단백질 동정 20
2) 계대별 CD112 (Nectin-2) 발현의 변화를 추적 21
3) Nectin-2 blocking 항체를 이용해 후기내피세포에서 Nectin-2의 기능 억제시의 생물학적 효능 21
4) shRNA를 통해 후기내피전구세포에서 Nectin-2의 발현이 억제된 세포주를 확인 22
5) Nectin-2의 발현이 억제된 후기내피전구세포의 기능을 실험함 22
6) Nectin-2의 기능이 p-Erk를 경유함을 확인 23
7) BST-2 (CD317) 세포표면 마커 발굴 23
8) 후기내피전구세포 (OEC)에서의 IFN-γ 특이적 BST-2의 발현 유도 확인 23
9) IFN-γ가 처리된 OEC에서의 혈관형성능 확인 23
10) IFN-γ에 유도된 BST-2 발현에 의한 세포간 결합력 확인 24
11) IFN-γ에 의해 유도된 BST-2의 결합 유무 확인 24
8. 혈관내피전구세포에서 혈관내피세포로의 각 분화 단계별 세포의 유전체 분석 25
1) 유전체 분석(NGS)을 위한 OEC 시료 확보 25
2) 후기내피전구세포에서 HHIP의 발현정도를 확인 25
3) shRNA를 이용한 후기내피세포에서 HHIP의 발현 감소를 유도 25
4) HHIP의 기능을 Hedgehog Signal 과 연관하여 확인 26
5) HHIP 저발현 후기내피세포주에서 증가된 혈관분화 및 Proliferation 확인 26
6) 초기내피전구세포에서HHIP의 기능을 Hedgehog signal과 연관하여 확인 27
7) CD276 (B7-H3) 마커 후보물질 발굴 및 기능평가 수행 27
8) CD276 의 기능을 검증 실험 27
9) CD276 knockdown에 의한 혈관신생능 향상 유도 28
9. 기능성 내피전구세포의 대량 배양 및 생산 기술 확립 및 VEGF 혹은 HGF 발현 중간엽 줄기세포(MSC)의 증식율 증가 효과 29
1) 정상산소압(20%)에서의 VEGF/HGF 발현 중간엽 줄기세포의 증식율 비교 29
2) 저산소압(1%)에서의 VEGF/HGF 발현 중간엽 줄기세포의 증식율 비교 29
3) 저산소 배양 환경에 따른 노화 마커의 변화 30
4) 산소압변화에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 노화반응을 조절하는 인자 스크리닝 31
5) BMI1 발현에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 노화반응 변화 31
10. 표면계질 변화된 스텐트에서의 혈관성장인자 유도물질 분비 줄기세포주의 생착능, 생존율 및 기능 평가 32
1) VEGF를 발현하는 줄기세포주의 기능성 스텐트 표면에서의 부착 확인 및 부착 후 혈관형성유도 물질 분비유무 확인 32
2) 기능성 스텐트에 부착된 혈관성장유도인자 분비 세포주의 유도물질 분비 확인 33
3) 혈관성장인자 분비 줄기세포주의 기능성 스텐트에서 생존률 확인 33
4) HGF를 발현하는 줄기세포주의 스텐트 표면에서의 부착 확인 및 부착 후 생존율 확인 34
5) HGF 발현 줄기세포주의 기능성 스텐트에서 생존률 확인 34
11. 혈관성장인자 발현 줄기세포주가 부착된 기능성 스텐트의 대동물 돼지에서의 효능 및 안정성 평가 34
1) 1차 대동물 실험 그룹군 34
2) 혈관성장인자 분비 줄기세포가 부착된 기능성 스텐트 삽입 후 2주 뒤의 결과 35
12. 스텐트 재료 시편 위에서 HGF와 VEGF를 발현하는 세포의 생존률과 증식력 증가 확인 37
13. 스텐트 재료 시편 위에서 HGF와 VEGF를 발현하는 세포의 특성 변화 확인 38
14. 특수 코팅된 스텐트 위에 세포 부착 여부 확인 39
15. HGF/VEGF 세포의 혈관형성 능력 39
16. HGF VEGF 분비되는 세포가 부착된 스텐트의 neointima 형성정도 확인 40
17. HGF/VEGF 세포를 부착한 스텐트를 이용 시, 재내피화 촉진을 확인 41
18. 스텐트에 부착된 세포의 in vivo model내 흔적 확인 42
19. HGF VEGF 분비 줄기세포의 종양 비형성 확인 42
20. 항체(CD112)와 HGF VEGF 줄기세포를 융합한 스텐트의 효능 43
제4장 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 43
1. 목표 달성도 43
2. 관련 분야 기여도 45
제5장 연구개발성과의 활용계획 45
제6장 연구 과정에서 수집한 해외 과학기술 정보 46
제7장 연구개발성과의 보안등급 48
제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황 48
제9장 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전 조치 이행 실적 48
제10장 연구개발과제의 대표적 연구 실적 49
제11장 기타 사항 54
제12장 참고문헌 54
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원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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