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목차
제1장 연구개발과제의 개요 12
1. 연구개발 목적 12
2. 연구개발의 필요성 13
1. 3차원 세포 클러스터 형성의 필요성 13
2. 기존 3차원 세포 형성 방법 13
3. 새로운 3차원 세포 형성 기술의 요구 및 전망 14
4. 기능성 나노구조체를 이용한 3차원 형성법의 장점 15
5. 유도 만능줄기세포로의 역분화를 위한 생체분화 가능하고 임상가능한 최적화적인 유전자 전달체 개발의 필요성 15
6. 줄기세포를 이용한 근골격계 조직공학 연구의 필요성 15
7. 생리활성 생체재료로 이루어진 하이드로겔과 자성 나노입자를 이용한 근골격계 조직공학연구의 필요성 16
8. 경제적 산업적 측면의 필요성 16
9. 사회적 문화적 측면 16
10. 나노기술 융합된 세포 연구의 필요성 17
3. 연구개발 범위 17
제2장 국내외 기술 개발 현황 21
1. 국내 관련 분야 기술개발현황 21
2. 국외 관련 분야 기술개발현황 21
제3장 연구 수행 내용 및 성과 23
1. 3차원 세포 구조 형성을 위한 자기력 시스템 셋업 38
(1) 하나의 영구 자석에 철 핀이 있는 시스템과 없는 시스템의 자기력 비교 38
(2) 일련의 집합을 이루는 영구 자석에 철 핀이 있는 시스템과 없는 시스템의 자기력 비교 39
(3) 영구 자석에 철 핀이 있는 시스템과 없는 시스템의 세포 응집 비교 40
2. 3차원 세포 구조물을 위한 다양한 조건의 최적화 41
(1) 자성 나노 입자가 도입 된 세포의 수에 따른 클러스터의 크기 41
(2) 3차원 세포 클러스터 형성 시간 43
(3) 자성 나노 입자의 농도 43
3. 자성 나노 입자가 도입된 세포의 생존력 확보 44
(1) 화학적으로 합성 된 자성 나노 입자의 세포 독성 (3세부 협력) 44
(2) 생물학적으로 합성 된 자성 나노 입자의 세포 독성 44
4. 3차원 세포 배양이 세포의 생존력에 미치는 영향 45
5. 다른 종류의 세포를 사용하여 다양한 형태의 3차원 세포 클러스터 형성 46
(1) 두 가지 다른 세포의 무작위적 섞임 46
(2) 두 가지 다른 세포가 층을 이루어 3차원 세포 클러스터 형성 46
(3) 두 가지 다른 3차원 세포 클러스터의 응집 46
6. 세포 응집 시스템에 따른 3차원 세포 클러스터 간 응집 양상 비교 47
7. 3차원 줄기세포 클러스터의 배양 동안 일어나는 분화 양상 관찰 48
8. iPSCs 제작을 위한 조건 확립 및 효율성 검증 49
9. 마우스 iPSCs 역분화 유도 및 제작 50
10. 인간 iPSCs 역분화 유도 및 제작 54
11. iPSCs 3차원 줄기세포 형성 조건 확립 56
12. iPSCs 3차원 줄기세포 분화방법 확립 57
13. iPSCs 3차원 줄기세포 형성을 통한 역분화 효율 증대 유도 59
14. 생물학적 합성 자성나노입자 표면개질화 (3세부 협력) 60
15. 기능성 나노구조체 확보 및 세포독성, 기능성 확인 (3세부 협력) 61
16. iPSCs 역분화 시 비바이러스성 생체재료의 영향과 효과 63
17. iPSCs 역분화 시 나노구조체 자체의 영향 검토 64
18. 나노구조체를 기반으로 하여 인간배아줄기세포와 feeder cell (transfected with DsRed)의 다양한 형태 공배양 시도 65
19. 나노구조체를 기반의 다양한 크기의 3차원 줄기세포 형성 66
20. 자성나노입자 기반의 자기력 시스템 하 3차원 줄기세포의 초기 분화 확인 67
21. 자성나노입자 도입 원심분리에 의한 3차원 중간엽줄기세포의 장기 분화 확인 68
(1) 자성나노입자가 도입 중간엽줄기세포의 자기력 기반 물리적 자극에 의한 연골분화 68
(2) 자성나노입자의 중간엽줄기세포에의 도입 69
(3) 자성나노입자 기반의 3차원 중간엽줄기세포의 연골 조직으로의 분화 확인 70
21. 연골로 분화시킨 나노구조체 기반의 3차원 중간엽줄기세포의 tissue assembly 가능성 타진 71
23. 이종 조직 세포 간 혼합 assembly 시도 72
24. 크기가 서로 다른 3차원 줄기세포에서 발현되는 transcription factor의 레벨 차이 확인 73
(1) 크기가 서로 다른 3차원 줄기세포에서 외배엽성 분화 세포의 transcription factor인 Gfap의 발현 레벨 비교 73
(2) 크기가 서로 다른 3차원 줄기세포에서 내배엽 및 중배엽성 분화 세포의 transcription factor인 Brachyury (T)의 발현 레벨 비교 74
25. 신경분화 마커 발현 확인 및 세포의 phenotype 관찰 75
26. 자성나노입자를 이용한 줄기세포의 삼차원 형태 구현 및 tissue assembly의 효과적인 형성을 위한 줄기세포의 분화 안정성 확보 (2세부 협력) 76
(1) 자성나노입자의 농도에 따른 중간엽줄기세포의 모습 관찰 76
(2) 자성나노입자 및 외부자기력시스템을 이용한 삼차원 줄기세포 구현 77
(3) 2차원과 3차원 중간엽줄기세포의 연골분화 유도 비교 79
27. 자성나노입자를 이용한 줄기세포에의 물리적 자극 전달과 이를 통한 세포 내 mechanotransduction 유도 81
(1) 자성나노입자를 이용한 물리적 자극 전달 방법에 대한 논의 81
(2) 자성나노입자 기반의 물리적 자극에 대한 중간엽줄기세포의 골분화 반응 82
(3) 자성나노입자 기반의 물리적 자극에 대한 세포 단위의 정량화 83
28. 자성나노입자를 이용해 줄기세포의 세포 간 interaction을 증진시키고 이를 통해 분화에 적합한 extracellular matrix (ECM; 세포외기질) 분비를 유도 (2세부 협력) 84
(1) 자성나노입자를 이용한 삼차원 조골전구체 줄기세포 구현 및 세포외기질 분비 유도 84
(2) 세포주로부터 수집한 세포외기질의 분리 및 이를 이용한 삼차원 스캐폴드 제작 86
29. 심장의 심실벽 구성 조직인 심근조직의 효과적인 구현을 위해 이를 구성하는 주요 세포인 cardiac fibroblast와 cardiomyocyte를 in vivo (mouse) 로부터 분리 (2세부 협력) 88
30. 세포치료제로서 생체 내에 이식하는 세포의 효율 증대를 위한 자성 기반의 retention 기법에 대한 논의 89
31. 동물 두개골 결함 모델에 이식한 줄기세포 및 scaffold를 이용한 골분화 및 골조직 재생 확인 (2세부 협력) 90
32. 세포주 유래 물질 (세포외기질)을 이용한 in vivo 모사 환경 구현 91
(1) 세포주로부터 세포외기질을 효과적으로 분리 및 정제 91
(2) 분리해 낸 세포외기질의 속성 확인 및 표면 관찰 92
(3) 분리 및 정제한 세포외기질을 이용한 in vivo 모사 삼차원 구조체에서 세포 배양양 93
33. 세포주에서 분리 및 정제한 세포외기질을 이용해 구현한 in vivo 모사 환경의 줄기세포 골분화유도능 확인 94
34. 피부세포의 증식 및 피부조직의 상처 치료에 관여하는 bFGF의 단백질 안정성 증진을 위한 30Kc19a와 bFGF의 결합단백질 이용 96
(1) 30Kc19a와 bFGF 결합단백질의 생산 96
(2) 시간의 흐름에 따른 단백질 안정성의 비교 97
(3) 결합단백질의 in vivo 적용 가능성 검토를 위한 wound healing assay 98
34. 상처난 in vivo 모델에서 30Kc19a- bFgF 결합단백질의 wound healing 효과 확인 99
(1) 피브린 겔을 이용한 in vivo 모델에서 상처부위 치료 효과 확인 99
(2) 피부 조직의 상처가 재현된 in vivo 모델에서 bFGF와 30Kc19a-bFGF의 상처 치유 효과의 조직학적 비교 분석 100
36. 역분화 유도를 위한 PBAE 합성 및 유전자 전달 시스템 분석 102
(1) PBAE 합성 및 세 종류의 디아민기로 말단작용기 개질 102
(2) gWIZ-GFP reporter 또는 MC-LGNSO 전달 시스템의 조건 셋업 102
37. gWIZ-GFP reporter를 이용한 transfection 효율 분석 103
38. MC-LGNSO 전달을 위한 조건 최적화 104
39. 역분화가 유도된 세포의 분석 105
40. High- throughput 기술을 통한 분화 유도 지지체 개발 106
(1) High-throughput 기술 개발에 사용할 poly urethane acrylate 기반의 재료 106
(2) High-throughput 유도 지지체 형판 106
(3) 분화를 최적화하기 위한 세포외기질 단백질 도입 107
(4) 분화를 최적화하기 위한 단백질의 농도 107
(5) 지형적 지지체 개발 108
41. 유도 만능줄기세포의 분화 효율 분석 109
42. DNA methylation을 통한 후생학적 변화 확인 110
43. RT- PCR, 면역염색법 분석을 이용한 분화 학인 111
44. Poly urethane acrylate 기반의 고분자 레진을 이용한 세포모양을 모방한 지지체 개발 112
45. 근육세포모방 지지체에서의 성체줄기세포의 반응확인 113
46. 근육세포모방 지지체에서의 성체줄기세포의 근골격계 분화 프로토콜 확립 114
47. Poly ethylene glycol과 히알루론산, chondoritin sulfate기반의 고분자 하이드로겔을 RGD 펩타이드와 함께 이용한 세포지지체 확립 115
48. 3차원 고분자 하이드로겔을 이용한 세포 배양 116
49. 3차원 고분자 하이드로겔 지 지체에서의 연 골 세포의 반응확인 117
50. 자성나노입자를 이용한 세포 스페로이드 형태의 복합적 형체 확립 119
(1) 자성나노입자 농도에 따른 세포의 생존율 119
(2) 자성나노입자로 생성된 세포 스페로이드의 형태 확인 120
51. 줄기세포 스페로이드의 연골세포로의 분화 확인 121
52. 스페로이드의 외부 자극으로 인한 세포 영향 연구 122
53. 외부적인 힘인 전기자극을 도입하여 근골격계 분화조건 확립 123
(1) 전기자극을 도입하기 위한 조건 확립 123
(2) 전기자극을 이용하여 근골격계 분화조건 확립 124
54. 전기자극을 도입한 3차원적인 생체적합한 하이드로겔에 포함되어 있는 세포의 분화 125
(1) 생체유래 재료로 만든 하이드로겔의 세포분화 능력 125
(2) 전기자극이 도입된 하이드로겔 안에서 분화 126
55. 생체유래 하이드로겔의 물성을 자극시켜 근골격계 세포로의 분화 유도 127
56. 유도 만능줄기세포 유래 간엽줄기세포 확립 128
57. 유도 만능줄기세포 유래 간엽줄기세포의 골분화 129
(1) In vitro 상에서의 골분화 능력 129
(2) In vivo 상에서의 골 조직 재생 능력을 두개골 결함 동물모델로 확인 130
58. 세포 표면 개질을 통한 효율적인 생체 내 세포 이미징 및 약물전달 시스템 개발 131
(1) 세포 표면 개질 조건 확립 131
(2) 세포 표면 개질을 이용한 나노 입자 코팅 및 약물 전달 조건 확립 132
(3) 생체고분자와 나노 입자 동시 코팅을 통한 생체 내 세포 이미징 및 약물 전달 133
59. 제대정맥혈관내피세포에서부터 골세포로의 직접교차분화 134
(1) 혈관내피세포로 전분화능 Oct4 유전자 전달 및 BMP-4 성장인자 처리 134
(2) 혈관내피세포의 골세포로의 골분화 확인 135
60. graphene oxide가 함유된 하이드로겔의 줄기세포 골분화 유도 기술 확립 136
(1) polyethylene glycol - graphene oxide conjugate 합성 및 지방유래줄기세포 배양 136
(2) GO 하이드로겔의 골분화 유도능 확인 137
61. 자성 나노 입자 도입한 하이드로겔 기반의 LBL(layer- by- layer) 시스템 구축 138
(1) 전기적 상호작용에 의한 LBL(layer by layer) 코팅 138
(2) 패턴의 임베디드 및 세포 얼라인 유도 139
(3) 하이드로겔의 조직 부착성 확인 140
62. 구축된 하이드로겔 기반의 LBL 시스템에 자성나노입자 임베딩 141
63. PBAE기반의 FGF- 2를 담지한 다층박막 제조 142
64. 온도감응성 고분자인 PNIPAAM 기반의 세포 시트 제조 143
65. 생체적합성 자성나노입자 합성 (1세부 협력) 144
66. 박테리아유래 자성나노입자 표면 개질을 통한 생체 적합성 증대 (1세부 협력) 145
67. 화학적으로 합성된 자성나노입자의 표면 개질 146
68. 성장인자 방출거동 제어 및 줄기세포 증식 증대 (1세부 협력) 147
69. 성장인자 방출 거동 제어 및 줄기세포 증식 증대 148
70. 그래핀 옥사이드 시트를 이용한 단백질 방출 조절 박막 제조 149
71. 세포 안정성 및 분화능을 가지는 나노 ECM 제조 150
72. 선택조립형 나노필름을 이용한 세포 시트 다기능화 기술 개발 151
73. 우루시올의 생체 적합성 파악 152
73. 나노입자 기반의 유전자 전달 나노입자 개발 153
74. 성장인자가 담지된 플랫폼에서의 약물방출 거동 제어 154
75. 약물담지가 가능한 마이셀을 이용한 약물 방출 제어 다층박막 제조 155
76. 다기능성 나노입자의 개발을 위한 생체 적합성 물질 라이브러리 확립 156
77. 최적화된 gene delivery를 위한 자성나노입자와 siRNA 입자 복합체 제조 158
78. 자성나노입자의 자성을 이용하여 gene delivery 효율 증대 159
79. 세포 시트 표면 다층박막 코팅 제조 160
80. free- standing 세포 시트의 물리적인 안정성 증대를 위한 다층박막 코팅 제조 161
81. 세포 시트에서의 약물 방출을 위한 free- standing 나노박막 복합체 제조 162
82. 유도만능줄기세포 배양 플랫폼을 위한 bFGF 포함 다층박막 제조 164
83. 나노입자 표면 다층박막 코팅을 통한 토끼 각막의 조직재생 및 생체 적합성 테스트 진행 166
84. 줄기세포의 조골세포로의 분화 증대를 위한 다층박막 코팅 및 조직재생 168
85. 줄기세포의 연골세포로의 분화 증대를 위한 다층박막 코팅 및 조직재생 170
86. 이식된 줄기세포 생존률 증대를 위한 다층박막 코팅 171
제4장 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 174
1. 목표 달성도 174
(1) 연구개발의 최종목표 174
(2) 연차별 연구개발 목표 및 내용 176
(3) 계획대비 달성도 181
(4) 위 연구목표 183
2. 관련 분야 기여도 184
제5장 연구개발성과의 활용계획 185
1. 추가연구의 필요성 185
2. 다른 연구에의 응용 및 기업화 추진방안 185
제6장 연구 과정에서 수집한 해외 과학기술 정보 190
제7장 연구개발성과의 보안등급 191
제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황 192
제9장 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전 조치 이행 실적 193
1. 실험실 안전 점검 체계 193
2. 안전조치 이행실적 193
3. 안전 관리 대책 194
제10장 연구개발과제의 대표적 연구 실적 197
제11장 기타 사항 201
제12장 참고문헌 202
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원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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