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Abstract
목차
I. 서론 15
1. 연구사업의 배경 15
2. 연구사업의 목적 24
II. 연구내용 및 방법 26
1. 연구사업의 범위 및 내용 26
2. 연구추진계획 32
III. 연구결과 및 고찰 35
1. 난분해성 물질 분해 활성이 높은 균주로부터 물질 분해효소 유전자 클로닝 및 기능검증 35
1) PAHs에 의해 발현이 유도되는 난분해성물질 분해효소 유전자의 mRNA 발현 분석 35
2) 난분해성 물질 분해효소 유전자 cloning 과 Pichia pastoris 를 통한 효소단백질 과발현 및 기능 검증 46
2. 난분해성물질 분해활성이 우수한 느타리버섯 균주의 발현유전체 분석 60
1) 배양조건 및 발달 단계별 발현유전체 확보 60
2) mRNA 추출 64
3) 난분해성 물질에 의해 발현이 조절되는 대표 유전자군의 발현양상 분석 64
IV. 결론 86
V. 기대성과 및 활용방안 88
VI. 참고문헌 90
Table 1. 주요 화학물질과 용도 15
Table 2. 각균주별 난분해성 물질 분해 활성특성 28
Table 3. 균사체에서 malachite green에 의하여 up-regulation되는 유전자들 68
Table 4. 균사체에서 malachite green에 의하여 down-regulation되는 유전자들 69
Table 5. 균사체에서 naphthalene에 의하여 up-regulation되는 유전자들 71
Table 6. 균사체에서 naphthalene에 의하여 down-regulation되는 유전자들 71
Table 7. 자실체에서 malachite green에 의하여 up-regulation되는 유전자들 73
Table 8. 자실체에서 malachite green에 의하여 down-regulation되는 유전자들 74
Table 9. 자실체에서 naphthalene에 의하여 조절되는 유전자들 74
Table 10. laccase 유전자의 발현 75
Table 11. peroxidase 유전자의 발현 76
Table 12. cytochrome p450 monooxygenase 유전자의 발현 77
그림 1. PAH의 종류 16
그림 2. Pseudomonas에 의한 naphthalene 분해경로(일부) 17
그림 3. Mycobacterium sp.에 의한 pyrene 분해경로 18
그림 4. PAH 의 분해경로 19
그림 5. Lignin peroxidase의 반응기작 20
그림 6. Mn peroxidase와 laccase의 lignin 분해반응 기작 20
그림 7. Mn peroxidase와 laccase의 phenanthrene 분해 21
그림 8. Cytochrome P-450 monooxygenase에 의한 phenanthrene 분해 21
그림 9. 간버섯의 aromatic hydrocarbon 분해능 분석(3% diesel, 1주일 배양) 22
그림 10. HPLC 분석 : 느타리버섯의 malachite green 분해능 23
그림 11. 느타리버섯 laccase 및 peroxidase (lignin + Mn) mRNA 발현 23
그림 12. 분해 효소 유전자의 효모 발현벡터 cloning 24
그림 13. S. cereuisiae에서 발현된 버섯유전자의 활성측정 24
그림 14. 느타리버섯 laccase 유전자군 비교. 29
그림 15. 느타리버섯 peroxidase 유전자군 비교. 29
그림 16. 느타리버섯 p450 monooxygenase 유전자군 비교. 30
그림 17. 느타리버섯 IUM1873 균주 발현유전체 분석 과정. 31
그림 18. 난분해성물질 분해 효소활성. 36
그림 19. Laccase 와 peroxidase 활성에 대한 copper의 영향 36
그림 20. 난분해성물질 분해효소유전자의 발현. 37
그림 21. 간버섯의 난분해성물질 분해효소활성 38
그림 22. 간버섯의 laccase활성에 대한 구리이온의 영향 39
그림 23. 간버섯의 lignin peroxidase 활성에 대한 구리이온의 영향 40
그림 24. 간버섯의 laccae 활성에 대한 pH의 영향 40
그림 25. 간버섯의 난분해성물질 분해효소유전자의 발현.... 41
그림 26. Native gel의 zymogram 42
그림 27. 간버섯 배양액에 의한 PAH분해-HPLC분석 43
그림 28. 간버섯 배양액에 의한 PAH분해 44
그림 29. 간버섯 배양액에 의한 PAH분해-Time course 45
그림 30. 분해활성 효소유전자의 클로닝을 위한 P. pastoris 발현벡터 클로닝 56
그림 31. P. pastoris 의 단백질발현에서 온도의 효과 57
그림 32. P. pastoris 의 단백질발현에서 methanol의 효과 58
그림 33. Methanol 농도가 세포성장 및 단백질 생산에 미치는 영향... 59
그림 34. 느타리버섯에 의한 malachite green 분해확인 60
그림 35. Naphthalene 과 Malachite Green 처리후 느타리버섯 재배초기 61
그림 36. 처리 느타리버섯 수확전 61
그림 37. 처리 느타리버섯 수확전 62
그림 38. Naphthalene과 Malachite Green존재시 느타리버섯의 자실체 형성 63
그림 39. mRNA 추출 64
그림 40. 느타리 버섯 RNASeq data 관리 웹페이지 65
그림 41. MA plot : 균사체에서 Malachite Green(Mc-MG),... 66
그림 42. MA plot : 자실체에서 Malachite Green(FB-MG),... 67
그림 43. RT-PCR : Malachite Green 처리에 의한 균사체 유전자 발현변화 69
그림 44. RT-PCR : Malachite Green 처리에 의한 균사체 유전자 발현변화 70
그림 45. RT-PCR : Naphthalene 처리에 의한 균사체 유전자 발현변화 72
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