표제지

제출문

목차

I. 연구개발 요약서 15

1. 연구용역의 추진근거 및 필요성 15

2. 연구용역의 최종목표 16

3. 연구개발의 주요 내용 및 참여기관 별 역할 16

4. 주요결과 17

가. 정책지원 17

나. 위해성평가 기술 개발 19

다. 안전관리 기술 개발 21

라. 수산 환경 및 해양생태계 현황 조사 25

마. 수입검사 기술 개발 29

바. 안전관리 교육 32

II. 사업계획 33

1. 사업추진배경 33

2. 연구목적 및 연구개발의 필요성 34

가. 연구목적 34

나. 연구개발의 필요성 35

3. 연구과제 관련 국내외 동향 40

가. 연구 및 기술개발동향 40

4. 연구용역의 목표 및 내용 46

가. 연구용역의 최종목표 46

나. 연구용역의 주요내용 46

5. 연구개발 추진전략·방법 및 추진체계 47

가. 연구개발의 추진전략 47

나. 연구개발의 추진방법 52

다. 연구개발의 추진체계 57

6. 공동연구 추진계획 58

1) 참여기관별 역할 59

III. 연구과제의 범위 및 연구결과 60

1. 연구과제의 범위 60

가. 연구과제의 범위 60

2. 연구개발 결과 62

가. 해양수산용 LMO 안전관리 관련 정책 지원 62

나. 해양수산용 LMO 위해성평가 기술 개발 116

다. 해양수산용 LMO 안전관리 기술 개발 144

라. 환경영향평가 조사 233

마. 국경감시 기능 강화를 위한 LMO 수입검사기술 개발 291

바. 안전관리 교육 및 연구·생산 환경 안전진단 352

IV. 연구성과 활용방안 및 달성도 356

1. 연구성과(기대효과) 및 연구개발 결과의 활용방안 356

가. 연구성과(기대효과) 356

나. 연구개발 결과의 활용방안 358

2. 연구 추진일정 및 달성도 359

[표 1] 해양수산용 LMO 안전관리 지침서 감수 전문가 63

[표 2] 해양수산용 LMO 안전관리 지침서 배포 기관 리스트 64

[표 3] 급성독성 테스트 대상균주 및 표준시험생물 116

[표 4] 미세조류 농도결정 기준 117

[표 5] 중성 루골용액 조성 117

[표 6] Synthetic freshwater (SFW) 조성, pH 7.5 118

[표 7] GFP 유전자 검출 PCR 반응액 조성 및 PCR 조건 120

[표 8] EcoR I 제한효소 반응액 조성 120

[표 9] 대조군(SFW only) mortality scores 122

[표 10] 대조군(C. reinhardtii CC-621 야생형) mortality scores 122

[표 11] 실험군(C. reinhardtii CC-621 GFP 형질전환주) mortality scores 122

[표 12] GFP 유전자 잔존 여부 123

[표 13] miR-30e 발현 벡터 제작을 위한 primer sequence 134

[표 14] microRNA 30e의 primary microRNA sequence를 증폭하기 위한 primers 136

[표 15] 세포에서의 각 벡터에 의한 miR-30e 발현량 138

[표 16] 바이오협회 가입 기업의 설문조사 결과 147

[표 17] 미세조류 관련 논문의 주제별 발행 편수(2013-2017) 169

[표 18] 투고기관 유형별 미세조류 관련 논문 편수(2013-2017) 170

[표 19] 미세조류 형질전환 기술관련 투고 논문편수(2013-2017) 171

[표 20] 미세조류 활용분야별 연도별 논문투고 현황(2013-2017) 172

[표 21] 국내 논문에 활용되거나 언급된 주요 연구대상 속의 관련 논문 편수 173

[표 22] 각 기관의 연도별 특허등록 건수와 비중 174

[표 23] 미세조류 형질전환 기술관련 등록 특허 건수(2013-2017) 175

[표 24] 미세조류 활용분야별 등록특허 건수(2013-2017) 177

[표 25] 등록특허의 주요 활용대상 미세조류 속과 관련 특허 건수 178

[표 26] 최근 5년간 국가연구개발사업을 통해 기술이전된 미세조류관련 기술 180

[표 27] 부처별 기술료 발생 건수와 기술료 발생액 181

[표 28] 검색 DB 및 검색범위 184

[표 29] 검색식 도출 과정 185

[표 30] 검색어 선정 186

[표 31] 유전자변형관상어 관련 출판 논문 192

[표 32] 유전자변형잉어 관련 출판 논문 195

[표 33] 유전자변형 틸라피아 관련 출판 논문 196

[표 34] 유전자변형 클라미도모나스 관련 출판 논문 202

[표 35] 유전자변형 남조류 관련 출판 논문 204

[표 36] 유전자변형 클로렐라 관련 출판 논문 206

[표 37] 유전자변형 두날리엘라 관련 출판 논문 207

[표 38] 계통 간 교배 및 종간교배에 따른 잡종의 유도 유무, 그의 유도율 및 생존율 조사 211

[표 39] 생식학적 전이 여부 조사를 위한 형광바다송사리와 근연종간 1차 6주간 교배결과 212

[표 40] 생식학적 전이 여부 조사를 위한 바다송사리와 근연종간 2차 6주간 교배 결과 213

[표 41] 불임 3배체 형광바다송사리와 송사리간 15주 교배결과 214

[표 42] 유전자 검출용 primer 216

[표 43] 유전자 검출용 primer 217

[표 44] 유전자 검출용 primer 219

[표 45] 유전자 검출용 primer 220

[표 46] 유전자 검출용 primer 221

[표 47] 절식기간에 따른 화이트니그로 장기 내 LM유전자 검출 유무 222

[표 48] 절식기간에 따른 화이트니그로 배설물 내 LM유전자 검출 유무 222

[표 49] 장내 미생물 배양 결과 223

[표 50] 절식기간에 따른 넙치 장기 내 LM유전자 검출 유무 224

[표 51] 절식기간에 따른 넙치 배설물 내 LM유전자 검출 유무 224

[표 52] 장내 미생물 배양 결과 225

[표 53] 먹이생물 공급 후 모의 생태계 내 유전자 검출 현황 226

[표 54] TG 파우더 사료 공급 후 넙치 내부 장기의 LM유전자 검출 227

[표 55] 일반사료 공급 후 넙치 내부 장기의 LM유전자 검출 228

[표 56] 입식 기간에 따른 저서 패류 간췌장 내 LM유전자 검출 빈도 229

[표 57] 넙치 9주째 3가지 외래 유전자 소실 230

[표 58] 대수리 6주째 3가지 외래 유전자 검출빈도 230

[표 59] 넙치 12주째 이상 3가지 외래 유전자 소실 231

[표 60] 대수리 9주째 이상 3가지 외래 유전자 검출빈도 232

[표 61] 저서 및 사육수의 외래유전자 검출여부 232

[표 62] 남원 지역 패류의 절식기간에 따른 CaMV p35S 영역 검출율 234

[표 63] 남원 지역 패류의 절식기간에 따른 tNOS 영역 검출율 235

[표 64] 생물 서식지별 절식기간에 따른 CaMV p35S 영역 검출율 236

[표 65] 생물 서식지별 절식기간에 따른 tNOS 영역 검출율 236

[표 66] 생물 식성별 절식기간에 따른 CaMV p35S 영역과 tNOS 영역 검출율 237

[표 67] 관상어 사료 분석에 사용된 primers 238

[표 68] 관상어 사료 내 GM 곡물 유전자 분석 결과 240

[표 69] 구룡포 지역 생태계 모니터링 분석 248

[표 70] 여수 지역 생태계 모니터링 분석 249

[표 71] 당진 지역 생태계 모니터링 분석 250

[표 72] 기장 지역 생태계 모니터링 분석 251

[표 73] 용호 지역 생태계 모니터링 분석 252

[표 74] 수·해양생태계 조사를 위한 채수지점 및 현장사진 257

[표 75] 항생제 배지를 이용한 미세조류 생존여부 조사 결과 260

[표 76] 채집 지역별 메타지놈 염기서열 시퀀싱 결과 261

[표 77] 메타지놈 염기서열 비교분석 벡터 정보 262

[표 78] CLC WorkBench 프로그램을 이용한 메타게놈 분석결과(Contig mapping) 264

[표 79] CLC WorkBench 프로그램을 이용한 메타게놈 분석결과(Q30, 150 bp read mapping) 266

[표 80] 메타게놈 분석결과 정밀 판정 (Contig mapping) 268

[표 81] 메타게놈 분석결과 정밀 판정(Q30, 150bp read mapping) 275

[표 82] 분자진단시 이용한 프라이머 정보 278

[표 83] 분자진단시 PCR 조건 정보 278

[표 84] 우파루파 확보현황 281

[표 85] 블루라이트, 분자진단키트를 이용한 형광관상어 판별 결과 289

[표 86] EO-1a-2020의 염기서열 및 Blast 결과 294

[표 87] 시험에 사용된 연어 검체 295

[표 88] AquAdvantage® Salmon 검출 타겟 프라이머 서열 296

[표 89] IPC 후보군의 primer 서열 297

[표 90] Primer 투입 농도 결정 시험의 각 시험군 primer 농도 299

[표 91] Multiplex 반응 조성액 300

[표 92] 연어 샘플로부터 gDNA 추출 후 정량 결과 303

[표 93] 형광관상어 표준물질 확보 리스트 317

[표 94] Primer 리스트 318

[표 95] PCR 조건 319

[표 96] Danio-Blue-1의 면역 일정표 338

[표 97] Danio-Blue-2의 면역 일정표 338

[표 98] Danio-Green의 면역 일정표 339

[표 99] Danio-Orange의 면역 일정표 339

[표 100] Danio-Pink의 면역 일정표 339

[표 101] Danio-Red의 면역 일정표 339

[그림 1] 미세조류 독성테스트 모식도 53

[그림 2] 해양수산용 LMO 안전관리 지침서 주요내용 63

[그림 3] 제작된 유통 관리 종사자용 리플릿(LMO 소개 및 법률정보) 114

[그림 4] 제작된 유통·관리 종사자용 리플릿 115

[그림 5] 미세조류 배양액 세포농도 계수 117

[그림 6] 미세조류 농도 별 급성독성 예비실험 118

[그림 7] 조류대발생 기준농도 시 급성독성 실험 119

[그림 8] 형질전환주와 지표종과의 상호작용 관찰 121

[그림 9] GFP 유전자 잔존여부 PCR 결과 123

[그림 10] 수평적 유전자 이동 분석에 이용된 GFP 유전자 염기서열 124

[그림 11] 모의생태계 내에서 형질전환주와 지표종 혼합 배양 후 현미경 검경 결과 125

[그림 12] 3배체 유도 조건 126

[그림 13] Flow cytometry data (a, 2N＝1.60 pg; b, 3N＝2.40 pg) 127

[그림 14] 중기 염색체 분열상(a. 2N＝48 acrocentrics; b. 3N＝72 acrocentrics) 127

[그림 15] 3배체 암수 생식소 조직(a, 암컷; b, 수컷) 128

[그림 16] LED 램프 하에서 관찰된 형광보라색 바다송사리 129

[그림 17] 다양한 purple 유전자의 copy수를 가진 배수체 생산 방법... 130

[그림 18] copy수에 따른 다양한 형광보라색 바다송사리... 131

[그림 19] 형광현미경 하에서 copy수에 따른 형광강도... 132

[그림 20] primary microRNA-30e sequence를 삽입한 재조합 VHSV 생산용... 135

[그림 21] Vectors for the expression of miR-30e and a seed-region deleted... 137

[그림 22] The sequence of miR-30e sponge and the construction of miR-30e sponge vectors 138

[그림 23] Sponge-mediated reduction of reporter expression 138

[그림 24] Primary microRNA 30e의 nucleotide sequence 139

[그림 25] Primary microRNA 30e sequence를 삽입하여 제작한 rVHSV-A-miR30e... 139

[그림 26] Plaque assay를 이용한 rVHSV-A-miR30e의 생산 확인 및 titer 측정 140

[그림 27] 제작된 rVHSV-A-miR30e의 RT-PCR을 이용한 microRNA30e... 141

[그림 28] rVHSV-A-miR30e를 감염시킨 EPC cell에서 miR-30e 발현... 141

[그림 29] 각각의 재조합 바이러스 성장 비교 142

[그림 30] (A) EPC cell 감염 24 시간째 Q-PCR을 이용한 각각의 재조합... 142

[그림 31] 각각의 재조합 바이러스 감염에 의한 EPC cell의 면역... 143

[그림 32] 바이오협회 가입 기업 현황 145

[그림 33] LMO 연구 현황 설문조사 응답률 145

[그림 34] 기업연구소 연구 현황 146

[그림 35] 대면조사 벤처 기업 내 실험실 167

[그림 36] 투고기관 유형별 미세조류 관련 논문편수 비중 170

[그림 37] 투고기관 유형별 연도별 논문편수 170

[그림 38] 미세조류 관련 논문 중 미세조류 형질전환 관련 논문의 비중 171

[그림 39] 미세조류 관련 논문주제의 비중 172

[그림 40] 미세조류 관련 논문 주제의 연도별 변화 172

[그림 41] 미세조류 관련 논문 주제의 연도별 변화 174

[그림 42] 각 기관의 연도별 특허등록 건수 175

[그림 43] 미세조류 관련 등록특허 중 형질전환 관련 비중 176

[그림 44] 미세조류 관련 등록특허 중 형질전환 관련 특허 건수의 연간 변화 176

[그림 45] 미세조류 관련 특허 분야의 비중 177

[그림 46] 미세조류 관련 특허 분야의 연도별 변화 178

[그림 47] 제브라피쉬, 유전자변형 제브라피쉬, 제브라피쉬 리소스센터 188

[그림 48] 분류에 따른 논문 출판 건수, 제브라피쉬 관련 논문 출판건수 188

[그림 49] 연도별, 주제별 제브라피쉬 논문 출판 건수 189

[그림 50] 에스트로겐 검출을 위한 유전자변형 제브라피쉬, 에스트로겐 활성측정을... 190

[그림 51] 유전자변형 대서양연어, 유전자변형 대서양연어의 유전자 도입 모식도, 유전자변형 대... 193

[그림 52] 연도별, 주제별 유전자변형 연어 논문 출판 건수 194

[그림 53] 미세조류별 논문출판 건수 198

[그림 54] 미세조류 논문출판 건수 199

[그림 55] 연도별, 미세조류별 논문출판 건수 199

[그림 56] 미세조류별, 분류별 논문출판 건수 200

[그림 57] 연도별, 분류별 논문출판 건수 201

[그림 58] CaMV p35S와 tNOS영역 검출빈도 지도 255

[그림 59] LMO 연구시설 주변 수계 채수 방법. 채수, 현장 필터, 운반 256

[그림 60] 블로그를 통한 우파루파 분양 및 판매 관련 게시글 279

[그림 61] 인터넷 카페 및 동호회 내 미승인 해양수산용 LMO 관련 게시글 280

[그림 62] 확보된 형광 우파루파 주요 사진 281

[그림 63] 단백질면역 검사법 수행 결과 282

[그림 64] 중합효소연쇄반응을 이용한 EGFP 유전자 검출 282

[그림 65] EGFP와 유전자변형의심 생물체로 확보한 유전자서열 비교 283

[그림 66] 확보된 유전자 염기서열 정보 283

[그림 67] 일반인 대상 자진신고 안내 284

[그림 68] 미승인 유전자변형 형광우파루파 불법 수입·사육·유통 관련 보도자료 284

[그림 69] 청계천 수족관 거리 조사 업체 286

[그림 70] 관능검사를 통한 유전자변형 관상어 판별 287

[그림 71] 신속진단키트를 이용한 형광관상어 판별 결과 288

[그림 72] 강원도 고성의 트인바다 가두리 양식장 292

[그림 73] 삽입된 외래유전자의 프라이머 설계 MAP 296

[그림 74] 캐나다산 북태평양 연어와 샘플링 302

[그림 75] 국내 시판 중인 연어 및 샘플 확보 302

[그림 76] 시험물질의 AquAdvantage® Salmon 여부 확인 결과 304

[그림 77] 각 타겟 primer의 선정을 위한 gradient PCR 결과 305

[그림 78] 타겟 증폭 primer의 검출 LOD(limit of detection) 시험 결과 306

[그림 79] IPC primer 탐색 시험 결과 306

[그림 80] Primer 농도 탐색 시험 307

[그림 81] IPC primer 투입량 결정 시험 308

[그림 82] Annealing 시간 조정 시험 결과 309

[그림 83] PCR cycle 조정 시험 결과 309

[그림 84] Extension time 조정 시험 결과 310

[그림 85] 시험 조건의 유효성 비교 평가 311

[그림 86] 시험 물질에 대한 테스트 결과 312

[그림 87] 조성물의 건조 공정 비교 시험 결과 313

[그림 88] 비특이 증폭 원인 파악 시험 결과 314

[그림 89] 각 형광유전자별 PCR 결과 예상도 319

[그림 90] Primer 교차 테스트 결과 320

[그림 91] Primer 별 최적 annealing temperature 선정 결과 321

[그림 92] 형광유전자 및 내재유전자 서열 정보 및 primer 정보 322

[그림 93] Reagent 최적화 결과 323

[그림 94] Target primer 혼합 농도 결정 324

[그림 95] 최적 annealing 반응 시간 확인 324

[그림 96] 최적 extension 반응 시간 확인 325

[그림 97] IPC primer 선별 326

[그림 98] 신규 IPC primer 적용 농도 최적화 327

[그림 99] 시제품 건조 후 성능 테스트 327

[그림 100] Positive marker 성능 평가 328

[그림 101] Positive marker 유효성 검증 329

[그림 102] 유전자변형 형광관상어 다중 분자진단키트 현장 검증 결과 329

[그림 103] 유전자변형 형광관상어 신속검출진단키트 배포 331

[그림 104] Danio-Blue-1 서열 331

[그림 105] Danio-Blue-2 서열 331

[그림 106] Danio-Green 서열 331

[그림 107] Danio-Orange 서열 331

[그림 108] Danio-Pink 서열 332

[그림 109] Danio-Red 서열 332

[그림 110] Danio-Blue-1 선별 peptide 332

[그림 111] Danio-Blue-2 선별 peptide 332

[그림 112] Danio-Green 선별 peptide 332

[그림 113] Danio-Orange 선별 peptide 332

[그림 114] Danio-Pink 선별 peptide 333

[그림 115] Danio-Red 서열 333

[그림 116] Danio-Blue-1 Peptide 1, 2, 3의 conjugation 결과 335

[그림 117] Danio-Blue-2 Peptide 1, 2, 3의 conjugation 결과 335

[그림 118] Danio-Green Peptide 1, 2, 3의 conjugation 결과 336

[그림 119] Danio-Orange Peptide 1, 2, 3의 conjugation 결과 336

[그림 120] Danio-Pink Peptide 1, 3, 4의 conjugation 결과 337

[그림 121] Danio-Red Peptide 1, 2, 3의 Conjugation 결과 337

[그림 122] Danio-Blue-1 Peptide 1의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 341

[그림 123] Danio-Blue-1 Peptide 2의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 341

[그림 124] Danio-Blue-1 Peptide 3의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 342

[그림 125] Danio-Blue-2 Peptide 1의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 342

[그림 126] Danio-Blue-2 Peptide 2의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 343

[그림 127] Danio-Blue-2 Peptide 4의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 343

[그림 128] Danio-Green Peptide 1의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 344

[그림 129] Danio-Green Peptide 2의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 344

[그림 130] Danio-Orange Peptide 1의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 345

[그림 131] Danio-Orange Peptide 2의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 345

[그림 132] Danio-Orange Peptide 3의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 346

[그림 133] Danio-Pink Peptide 1의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 346

[그림 134] Danio-Pink Peptide 3의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 347

[그림 135] Danio-Pink Peptide 4의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 347

[그림 136] Danio-Red Peptide 1의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 348

[그림 137] Danio-Red Peptide 2의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 348

[그림 138] Danio-Red Peptide 3의 1, 2, 3차 boosting 후 혈청을 이용한 ELISA 역가 확인 349

[그림 139] 형광관상어 항체의 민감도 확인을 위한 Western blot 분석 351

[그림 140] 2018년 제1차 해양수산용 LMO 안전관리 교육 354

[그림 141] 2018년 제2차 해양수산용 LMO 안전관리 교육 355