산화 스트레스는 세포 내 활성산소종(ROS)의 생성을 통한 신경퇴행성장애, 암 및 염증을 비롯한 다양한 질병의 주요 위험 요인 중 하나이다. 과도한 ROS는 다양한 인간의 병리학적 과정의 원인으로 연관 되어있는 산화적 손상을 초래하고 단백질, DNA 및 지질을 비롯한 거대 분자를 손상시켜 결국 세포사멸로 이어진다. 따라서, ROS 레벨의 조절은 파킨슨병(PD) 및 산화적 스트레스에 의한 뇌 허혈을 포함하는 신경계 질환을 보호하는데 중요하다.
항산화단백질은 신경질환의 치료제로서의 잠재력이 크지만, 치료적으로 이용하기에는 세포내 침투가 약하고 세포막을 통과할 수 없기 때문에 제한적이다. Protein Transduction Domains(PTDs)는 세포막을 투과하기 때문에 외부로부터 치료용 단백질을 세포내로 효율적으로 전달할 수 있다. PTDs는 원형질막을 통과할 수 있는 능력 때문에, 단백질의 세포적기능 연구와 단백질 치료를 위한 큰 잠재력을 제공하는 유용한 도구이다. 본 연구에서는 허혈과 PD를 비롯한 산화적 스트레스에 의해 유발된 신경세포 질환에 대한 보호효과를 연구하기 위해 세포 투과성 PEP-1-GSTA2와 PEP-1-GLRX1 융합단백질을 발현 및 정제하였다.
Glutathione S-transferase alpha 2(GSTA2)는 glutathione S-transferase(GSTs) 계열의 패밀리 단백질로 산화스트레스에 대한 항산화기능 및 해독기능이 있는 것으로 알려져 있다. GSTA2 단백질은 화학독성과 산화스트레스 유발에 대한 세포생존에 있어서 결정적인 역할을 한다. 그러나, 허혈성 뇌손상에 대한 GSTA2 단백질의 효과는 아직 완전히 알려지지 않았다. 본 연구에서는 세포내로 침투된 PEP-1-GSTA2가 산화적 스트레스가 유발된 hippocampal neuronal (HT-22) 세포의 사멸 및 뇌 허혈성 동물모델로부터 보호하는지 여부를 연구하였다. 우리는 PEP-1-GSTA2가 HT-22 세포내로 침투되어 산화스트레스 하에서 HT-22 세포 생존력을 증가시킨다는 것을 보여주었다. 또한 세포내로 침투된 PEP-1-GSTA2는 ROS 수준과 DNA손상을 유의하게 감소시켰다. 또한, 침투된 PEP-1-GSTA2는 Akt, mitogenactivated protein kinase (MAPK), nuclear factor-kappaB (NF-κB)의 활성화뿐만 아니라 Bcl-2, Bax, Cleaved caspase-3, Caspase-9와 같은 세포사멸신호 단백질의 발현을 조절한다. 게다가, PEP-1-GSTA2는 허혈성 동물모델에서 동물 뇌의 CA1 영역으로 침투되어 허혈성 손상을 현저하게 보호하였다. 이러한 결과는 PEP-1-GSTA2가 산화적 스트레스에 노출된 HT-22 세포 및 허혈성 동물모델에서 산화스트레스에 기인하는 신경세포의 사멸을 억제한다는 것을 나타낸다. 따라서, PEP-1-GSTA2는 허혈성 손상을 포함하는 신경손상의 치료에 유용한 역할을 할 수 있다.
파킨슨 병 (PD)은 도파민성 뉴런의 소실을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환이다. PD의 병인은 명확하지 않지만 PD의 진행에 산화스트레스가 관련 되어있다. 본 연구에서는 PEP-1-GSTA2가 SH-SY5Y 세포에서는 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+)에 의해, PD마우스 모델에서는 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)에 의해 유발된 신경손상에 미치는 영향을 연구하였다. 우리는 PEP-1-GSTA2가 SH-SY5Y 세포로 빠르게 침투되고 ROS 레벨과 DNA 손상을 줄임으로써 MPP+에 의해 유도되는 독성으로부터 보호한다는 것을 증명했다. 또한 PEP-1-GSTA2는 Akt, MAPKs 및 NF-κB와 같은 다양한 세포 신호 전달 경로뿐만 아니라 Bcl-2, Bax, Cleaved caspase-3 및 Caspase-9를 포함한 세포사멸 단백질의 발현 조절을 현저하게 억제하였다. 게다가, substantia nigra (SN) 부분에 침투된 PEP-1-GSTA2는 MPTP에 의해 유발된 PD 마우스 모델에서 도파민성 신경세포 사멸을 현저하게 방지하였다. 이러한 결과는 PEP-1-GSTA2가 in vitro와 in vivo에서 도파민성 신경세포 사멸을 유의하게 보호한다는 것을 나타내며, PEP-1-GSTA2가 신경질환에 대한 잠재적 치료제 및 PD 치료 도구로써 제공될 수 있음을 제시한다.
Glutaredoxin-1 (GLRX1)은 thioredoxin superfamily의 산화환원 조절제로 항산화 기능을 통해 세포 생존에 중요한 역할을 하는 단백질이다. 그러나, PD에서 GLRX1단백질의 메커니즘과 기능은 명확하지 않다. 본 연구에서는 세포침투성 PEP-1-GLRX1의 MPP+로 유도된 도파민성 SH-SY5Y 세포 사멸과 MPTP로 유도된 PD 동물 모델에서 메커니즘과 기능을 조사하였다. 우리는 PEP-1-GLRX1이 SH-SY5Y 세포로 침투되어 세포내 ROS 수준 및 DNA 손상을 억제함으로써 MPP+로 유도된 세포사멸로부터 유의하게 보호한다는 것을 확인하였다. 또한 PEP-1-GLRX1은 Bax, Cleaved caspase-3 and Caspase-9를 포함한 apoptosis 관련 단백질의 발현수준과 Akt, MAPKs, apoptosis signal-regulating kinase1 (ASK1), NF-κB의 활성을 억제하였다. 게다가, immunohistochemical analysis를 통해 PEP-1-GLRX1이 SN으로 침투되어 MPTP에 의해 유발된 PD 마우스 모델에서 도파민성 신경세포 사멸을 현저히 억제한다는 것을 보여주었다. 이러한 결과는 PEP-1-GLRX1이 MPP+에 노출된 SH-SY5Y 세포와 MPTP로 유도된 PD 마우스 모델에서 도파민성 신경세포 사멸을 현저하게 억제함을 나타내며, PEP-1-GLRX1이 PD 및 산화 스트레스 관련 신경성 뇌질환에서 새로운 치료제로서 가능성이 있음을 시사한다.
이 연구에서 우리는 PEP-1-GSTA2와 PEP-1-GLRX1이 신경 세포 (HT-22 및 SHSY5Y) 내로 침투되는 것과, 산화스트레스와 Akt, MAPKs, NF-κB, 세포사멸 신호경로의 억제를 통해 산화스트레스로 유도된 신경세포의 사멸로부터 현저하게 보호하는 것을 입증하였다. 뇌허혈과 PD동물모델에서, 이 단백질들이 blood-brain barrier (BBB)통과하여 동물의 뇌로 침투되는 것을 확인하였고, 신경세포 사멸로부터 현저하게 보호하는 것을 확인하였다. 따라서 PEP-1-GSTA2와 PEP-1-GLRX1이 뇌허혈과 PD를 포함한 산화스트레스와 관련된 다양한 질병의 치료제로 가능성이 있음을 제시한다.