근위축성 측삭 경화증(ALS)은 운동 신경 세포의 사멸과 근육 약화를 초래하는 신경퇴행성 질환이다. ALS 마우스의 척수에서 많은 아미노산 농도에 차이가 있다는 보고가 있다. 이전의 연구에서 저분자량 아미노산 타우린 농도가 G93A 마우스에서 상당히 높고 TAUT 수송체의 활성이 증가한 것으로 나타났다. 또한 시트룰린과 같은 중성 아미노산 농도는 ALS 마우스에서 상당히 높은 반면 LAT 수송체 활성은 감소했다. 트립토판의 경우 농도의 큰 변화는 없으나 LAT의 수송체 활성은 감소되었다. G93A 마우스에서 라이신 농도가 상당히 증가한 것으로 보고 되어있지만 수송체 활성은 연구되지 않았다. 따라서 본 연구의 목적은 ALS 모델 세포주에서 수송체 활성과 라이신, 아르기닌과 같은 염기성 아미노산의 수송 특성을 알아보는 것이다. 또한 대표적인 염기성 화합물인 콜린(choline)과 페놀계 약물인 파에오놀(paeonol)도 선택하였다.
이 연구를 위해 control (WT, NSC-34/hSOD1wt로도 알려짐) 및 돌연변이형(MT, NSC-34/hSOD1G93A로도 알려짐) 세포주를 포함하는 NSC-34 세포주로도 불리는 하이브리드 세포주와 같은 운동 뉴런을 사용하였고, 수송 연구를 위해 [³H]L-lysine,[³H]L-arginine, [³H]choline 및 [³H]paeonol을 포함하는 삼중수소 방사성 동위원소를 사용하여 투과성을 살펴보았다. 유전자 녹다운 연구를 위해 다양한 표적 수송체의 siRNA를 사용하였다. 실시간 PCR 분석을 사용하여 mRNA 발현을 확인하였다. 또 세포 독성 분석을 위해서 MTT 분석을 사용하였다.
L-라이신은 필수 염기성 아미노산이며 형질전환 G93A 마우스에서 그 농도가 유의하게 높았다. 따라서 ALS 모델 세포주에서 수송 특성 및 수송의변화를 연구하였다. [³H]L-라이신의 수송은 NSC-3 세포주에서 시간 의존적, 전압 민감성 및 나트륨 의존적이었다. Small interfering RNA(siRNA) 연구는 양이온성 아미노산 수송체인 시스템 y+가 NSC-34 세포주에서 라이신의 수송을 매개한다는 것을 밝혔다. 라이신의 농도 의존적 수송은 두 세포주 모두에서 두 가지 포화 과정을 나타내었다. 높은 친화성 부위에서, WT 세포주에 비해 MT 세포주에서 친화성이 더 높고 수송능이 더 낮은 반면, 낮은 친화성 부위에서 수송능만 WT 세포주에 비해 MT 세포주에서 더 낮았다. 또한, [³H]L-라이신 흡수는 CAT-1/시스템 y+의 기질 및 억제제에 의해 강력하게 억제되었다. [³H]L-라이신의 투과성에 대한 속도론 분석은 두 세포주 모두에서 도네페질 및 베라파밀에 의한 경쟁적 억제를 보여주었다. 또한, NSC-34 세포주를 글루타메이트 및 기타 전염증성 사이토카인으로 전처리하면 [³H]L-라이신의 투과가 감소했다. CAT-1mRNA의 현저한 감소는 라이신 투과의 감소가 수송체의 발현 감소로 인한 것임을 보여주었다. 그러나 L-라이신의 첨가는 MT 세포주에서 수송 활성을 회복시켰다. 따라서 라이신은 염증 상태에 대한 신경 보호 효과를 나타냄을 알 수 있다.
L-아르기닌 보충은 운동 뉴런의 기능 장애를 지연시키고 형질전한 ALS 마우스의 수명을 연장하는 것으로 나타났다. 수송 특성을 조사하고 L-아르기닌으로 전처리 시 NSC-34 세포주에서 신경 산화질소 생성효소 (nNOS)의 발현 수준을 평가하는데 중점을 두었다. [³H]L-아르기닌 수송은 두 세포주 모두에서 나트륨 비의존성, 농도 의존성 및 전압 민감성이었다. 수송 과정은 포화되었고 2개의 친화성 부위를 보였다. 고친화도 부위에서 WT에 비해 MT 세포주에서 친화도가 낮고 수송능이 더 높았다. 수송능의 차이에 대한 분석은 시스템 y+가 두 세포주 모두에서 [³H]L-아르기닌의 수송을 주로 매개한다는 것을 밝혔다. 시스템 b0,+의 관여는 두 세포주 모두에서 약 23%였지만, 시스템 y+L은 WT에서만 관여한 반면, 시스템 B0,+는 MT 세포주에서만 발견되었다. nNOS 발현 수준은 WT 세포주에 비해 MT 세포주에서 유의하게 감소하였다. 구조유사제 연구에서 퀴니딘은 Ki 값이 0.64 mM로 MT 세포주에서 경쟁적 억제를 보인 반면, 가바펜틴은 WT 세포주에서 비경쟁적 억제를 보였다. 또한 아르기닌 및 시트룰린으로 전처리된 MT 세포주는 nNOS mRNA 수준을 상승시켰다. 이러한 결과는 ALS 모델 세포주에서 아르기닌의 감소된 수송을 나타내었고 아르기닌은 NSC-34 세포주에서 nNOS 발현의 조절한다는 것을 알 수 있다.
이전 연구에서 ALS SOD1G93A 마우스 모델에서 시냅스 간극에서 아세틸콜린 수치가 높아지면 신경근 접합부의 변성이 발생하여 운동 결함이 발생하는 것으로 나타났다. 콜린은 신경전달물질인 아세틸콜린 합성에 필수적인 성분이다. 따라서, 본 연구는 ALS 모델 세포주에서 콜린의 수송 특성 및 수송체 활성의 변화를 조사하는 것이다. [3H]콜린 투과는 농도, 시간 및 pH 의존적일 뿐만 아니라 전압에 민감하였다. Choline transporter (CHT)와 choline-like transporter 1(CTL-1)의 mRNA 발현을 검토하였다. NSC-34 세포주에서는 CHT가 발현되지 않았지만, CTL-1은 발현되었다. 따라 CTL-1이 ALS 모델 세포주에서 나트륨 의존 방식으로 콜린의 주요 수송체라는 것을 알 수 있다. 헤미콜리늄-3은 콜린 투과를 현저하게 억제하는 것으로 나타났다. 이뇨제 amiloride는 1.04 uM 의 50% 최대 저해농도(IC50) 를 보여 가장 활성이 높았다. 4일 동안 신경 성장 인자(NGF)로 전처리한 결과 [³H]콜린의 투과가 억제되었다. 또한, 염증 상태가 있는 경우 세포 생존력이 감소하였다. 콜린의 첨가는 염증 상태에 대한 보호 효과를 나타냈다.
신경 퇴행성 질환에서 신경 독성을 약 시키는 천연물 제제인 paeonol 의 연구 목적은 운동 뉴런과 유사한 ALS 세포주에서 paeonol의 수송과 paeonol의 항산화 효과를 위한 수송체를 확인하는 것이다. MTT 분석을 한 결과, 감소된 세포 생존력을 나타냈다. 그러나 paeonol의 첨가는 세포의 생존력을 정상 수준으로 회복시켰다. Paeonol의 수송은 두 세포주에서 시간과 pH 및 농도 의존적이었다. 속도론적 매개변수는 WT 세포주와 비교하여 MT 세포주에서 변경된 친화도 및 수송능을 나타내는 2개의 수송 부위를 나타냈다. 기 음이온 수송체1 (Oat1)/Slc22a6 siRNA로 형질전환된 MT 세포주는 대조군에 비해 [³H]paeonol 투과가 현저하게 증가하여 MT 세포주에서 상향 조절을 나타내었다. Pmat (Plasma membrane monoamine transporter) siRNA는 유전자 녹다운을 통해 paeonol의 투과를 감소시켰고 주로 WT 및 MT 세포주에서 paeonol의 수송을 담당했다.
결론적으로 염기성 아미노산인 라이신과 아르기닌은 염증 상태와 스트레스 유발 물질에 대한 신경 보호 효과를 보였다. 라이신과 아르기닌의 수송은 주로 시스템 y+에 의해 이루어졌다. 또한 콜린 수송은 NSC-34 세포주에서 나트륨 의존 방식으로 CTL1에 의해 수행되었으며 콜린은 염증 상태에 대한 보호 효과를 나타냈다. 또한, 파에오놀은 운반체 매개 수송 시스템을 통해 신경 보호 및 항산화 활성을 나타냈다. 질병 모델 세포주에서 Pmat 및 Octn1은 하향조절된 반면 Oat1은 상향조절되었다. 따라서, 이러한 염기성 아미노산 및 화합물은 ALS 치료제 개발의 표적이 될 수 있으며 운동 신경 질환의 증상 완화에도 도움이 될 수 있을 것이다.