어류 군집은 수생태계에서 중요한 역할을 수행하며, 급속한 환경 변화에 대응하기 위한 민감한 생물학적 지표이다. 어류의 생물다양성을 평가하기 위한 방법 중 하나로서 환경 시료에서 채취한 환경 DNA (environmental DNA, eDNA)를 다양한 마커를 이용하여 분석하는 연구가 이루어지고 있으나, 프라이머의 효율성을 비교한 연구는 부족한 실정이다. 또한 eDNA 메타바코딩 분석 과정 중 eDNA 서열을 알려진 분류군으로 할당하는 분류학적 할당은 중요한 과정 중 하나이나, Rhinogobius 속과 같은 특정 분류군의 경우 eDNA 서열이 종 수준으로 할당되지 않는 사례가 발생하여 분석을 어렵게 한다. 본 연구에서는 한강의 어종에 적합한 마커의 비교를 위해 미토콘드리아 cytochrome c oxidase subunit I (COI) 유전자와 12S ribosomal RNA (12S rRNA) 유전자 마커를 이용하여 환경 DNA (environmental DNA, eDNA) 메타바코딩을 수행하여 2022년 4월과 6월 한강의 어류 생물다양성을 평가하였다. 또한 eDNA 메타바코딩 분석의 유효성을 평가하기 위해 본 연구에서 eDNA 메타바코딩으로 식별된 종 목록과 이전 조사 데이터에 보고된 종 목록을 비교 분석하였다. 종 수준으로 분류되지 않은 한강 Rhinogobius 속의 염기서열을 종 수준에서 분류학적으로 할당하기 위해 데이터베이스에서 얻은 염기서열을 이용하여 XGBoost 기반 기계학습 어류 종 분류기를 구축하였다. eDNA 메타바코딩 분석 결과 총 7,015 및 633개의 대표 서열이 COI 및 12S rRNA 염기서열에서 각각 얻어졌다. 두 마커를 모두 이용하여 총 55종의 어류가 식별되었으며, 유전자 마커에 따라 검출된 종 수와 상대적 풍부도에 차이가 있었다. 알파다양성은 12S rRNA 마커를 이용한 경우 COI 마커를 이용한 경우보다 더 높았다. 이전 조사에서 기록된 종들에 대해 12S rRNA 마커를 이용한 경우 COI 마커보다 더 많은 종을 식별하였다. 12S rRNA 유전자를 이용하여 구축된 기계학습 분류기 중 가장 높은 평가점수를 받아 89.47 %의 정확도를 보인 Pseudo k-tupler composition (PseKNC)를 이용한 기계학습 분류기를 이용하여 eDNA 메타바코딩 분석에서 Rhinogobius의 염기서열을 할당하였으며, 모든 염기서열이 종 수준에서 할당되었다. 본 연구는 한강 어류에 적합한 eDNA 메타바코딩 유전자 마커를 비교하고, 종 수준에서 정확한 어류 생물다양성 분석을 위한 예비 연구로서 한강의 어류 생물다양성 평가를 위한 기초자료를 제공할 수 있다.