근위축은 노화나 암과 같이 다양한 요인에 의해서 발생하게 되며 특히 암 환자에게 있어서 항암제를 사용한 치료는 근위축을 악화시킬 수 있어 치료효과 감소와 사망률을 증가를 초래할 수 있다. 미토콘드리아 기능저하는 산화적 스트레스를 유발하여 근위축을 악화시키는 반면 예로부터 당삼의 뿌리는 항산화 효능을 지닌 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 연구를 통해 당삼 뿌리에서 추출한 creoside IV가 항암제 FOLFIRI에 의해 유도된 근위축과 미토콘드리아 기능에 미치는 영향을 in vitro와 in vivo 상에서 확인하고자 하였다.
먼저, C2C12 근육세포에 creoside IV를 0, 1, 10, 100 ng/mL 농도로 처리하여 MHC 염색과 qRT-PCR 실험을 통해 근생성 및 미토콘드리아 기능 관련 지표들을 확인하였다. 그 결과, creoside IV는 2-4개의 핵을 가진 MHC-양성 다핵의 근관 형성을 100 ng/mL 농도에서 증가시켰고, 핵이 5개 이상인 근관의 수는 농도 1, 10 ng/mL에서 대조군 대비 유의적으로 증가하였다. 또한 creoside IV는 Akt/mTOR/p70S6K pathway를 활성화하고 FoxO1를 저해하여 C2C12 근육세포의 단백질 합성을 증가시키며, 더불어 근원세포 분화를 촉진하여 근관세포 및 근섬유 형성을 개선시킬 수 있음을 확인하였다.
Creoside IV 처리군에서 대조군 대비 미토콘드리아 생합성 관련 지표 Pgc1α와 전자전달계 complex II를 구성하는 Sdha가 유의적으로 증가하였고, 미토콘드리아 다이나믹스(mitochondrial dynamics)관련하여 융합을 조절하는 Opa1 역시 유의적으로 증가하였으나, 미토콘드리아 분열을 조절하는 Drp1은 유의적으로 감소하였다. 이를 통해 creoside IV는 미토콘드리아 생합성 및 다이나믹스(mitochondrial dynamics)를 촉진하여 C2C12 근원세포 분화 및 근생성 증가와 연관이 있음을 확인하였다.
Wild type AB*zebrafish (Danio rerio)배아에 FOLFIRI와 creoside IV를 함께 처리하여 slow와 fast type 근육염색을 진행하였다. 마찬가지로 유전자 수준의 근생성 및 미토콘드리아 기능 변화는 qRT-PCR 실험을 통해 진행하였다. 또한, 미토콘드리아에서 형광을 발현하는 mitochondria-targeted green fluorescent protein (mito-EGFP) zebrafsih를 통해 미토콘드리아 표현형을 확인하였다. 더불어 C2C12 세포에 FOFLIRI와 creoside IV 100 ng/mL을 처리하여 근생성과 미토콘드리아 대사 관련 지표들의 단백질 발현량을 확인하였고 염색을 통해 미토콘드리아 양, 막전위, ROS양의 변화를 측정하였다.
그 결과, creoside IV는 FOLFIRI로 근위축을 유도한 zebrafish에서 myog, smyhc1, myhz2 유전자를 증가시키며 fast와 slow type 근육 모두에서 근위축을 완화시켰다. 또한 pgc1α, tfam, drp1, mfn2, sdha(Complex II), sdhb (Complex II), atp5fα1 (Complex Ⅴ)와 같은 미토콘드리아 대사 관련 유전자들의 조절을 통해 zebrafish에서 FOLFIRI로 유도된 미토콘드리아 기능 저하를 완화시켰다.
Creoside IV는 FOLFIRI로 근위축을 유도한 C2C12 세포에서 AKT, mTOR, p70S6K와 MHC의 단백질 발현량을 증가시켰고, FOLFIRI 단독 처리군에 비해 JNK와 FoxO1를 비활성화 시켜 근육분해지표인 MuRF1을 유의적으로 감소시켰다. 또한 creoside IV는 미토콘드리아 대사와 관련하여 ROS 생산과 AMPK 발현을 촉진시키는 미토콘드리아 막전위 손상을 감소시켰다. 더욱이 FOLFIRI 단독 처리군과 비교하여 creoside IV가 PGC1α, TFAM은 증가시키고 DRP1은 감소시킴을 통해 미토콘드리아 양을 증가시킨다는 것을 확인하였다.
이상의 연구결과들은 creoside IV가 근생성을 촉진하고 FOLFIRI 항암제로 인한 근위축과 미토콘드리아 손상을 완화시킴을 제시하였다. 따라서 본 연구를 통해 creoside IV가 항암치료를 받는 암 환자에게 발생할 수 있는 근위축 예방 및 치료를 위한 영양보충제 혹은 건강기능식품 후보소재로서의 가능성을 확인하였다.