1970년대에 식물의 성장 호르몬인 브라시노스테로이드 (brassinosteroid (BR))가 발견되었고, 이후 다양한 연구들을 통해 BR이 식물의 성장 전반에서 역할을 함이 규명되었다. BR은 식물의 세포 생장, 세포 분열, 뿌리 성장, 광 형태 형성, 기공과 관다발의 분화, 발아, 면역과 생식 과정을 조절한다. BR이 없을 때에는 전사인자 BES1과 BZR1이 BIN2에 의해 인산화 되어 있고, 인산화된 BES1과 BZR1은 cytosol에서 E3 ligase에 의해 degradation된다. 그러나 BR이 있으면 BR receptor인 BRI1이 BR을 인지하여 결합하고 co-receptor인 BAK1과 receptor complex를 이루면서 BR의 신호전달이 시작된다. 이 후 BIN2가 KIB1을 통해 degradation이 이뤄지며, BES1과 BZR1은 PP2A phosphatase에 의해 탈인산화 된다. 탈인산화된 BES1과 BZR1은 nucleus에서 DNA의 E-BOX나 BRRE-motif에 결합하여 BR에 의해 유도되거나 억제되는 유전자들의 발현을 조절한다고 알려져 있다. RAV1은 BR에 의해 억제된다고 잘 알려진 유전자이다. 본 연구실에서 앞선 연구를 통해, 식물 특이적인 전사인자인 RAV1의 과발현이 애기장대의 성장의 심각하게 저해한다는 내용을 보고한 바 있다. 이에 따라, BR이 성장 유도 호르몬이고, RAV1의 과발현이 심각한 성장 저해를 보이는 것은, BR에 의한 RAV1의 억제가 식물을 적절히 성장시키는 것인지 생각하게 되었고 이를 알아보고자 연구를 수행했다.
우선적으로 rav1 돌연변이체와 RAV1 과발현체에서 표현형을 확인해 보았을 때, RAV1 과발현체에서 줄어든 BR 반응성을 확인했다. 더욱이 RAV1 과발현체에서 BR 생합성 유전자들의 발현이 감소해 있고, BZR1의 발현은 차이가 없으나 특이적으로 BES1의 발현이 억제되고 있었다. 종합적으로 RAV1의 과발현에 의해 BR 대사 과정과 신호전달이 제대로 이루어지지 않고 있음을 확인했다. Large-scale transcriptome 분석에서 RAV1이 BES1과 BZR1의 target 유전자가 될 수 있다는 보고가 있었으나, 현재까지 실험적 근거가 없었다. 이에 따라 RAV1의 발현이 BES1에 의해 조절되는지 검증하고자 하였고, RAV1 프로모터에서 BES1이 binding 한다고 알려져 있는 G-box, E-box, BRRE motif를 확인했다. 이후 BES1이 RAV1의 프로모터에 binding 하고 RAV1의 발현을 억제하고 있다는 것을 확인했다. 흥미롭게도, BES1의 프로모터에도 RAV1이 binding 한다고 알려져 있는 AP2 domain과 B3 domain을 확인하였고, RAV1 역시 BES1의 프로모터에 binding 하고 BES1의 발현을 억제한다는 것을 밝혔다. 전사인자인 RAV1과 BES1이 서로의 발현을 직접적으로 억제한다는 것을 보았기에, 두 단백질이 과도하게 존재하는 식물체를 통해 표현형을 확인해보고자 하였다. Gain-of-function 돌연변이체인 bes1-D는 내재적인 BES1 단백질의 과량 발현 때문에 지속적으로 BR signaling이 활성화 되어 결과적으로 petiole과 잎의 길이 성장이 촉진된 표현형을 보인다. Bes1-D 돌연변이체에 RAV1을 과발현 시킨 식물체에서는 bes1-D의 표현형이 억제되어 있었고, 더욱이 이러한 억제시키는 정도는 RAV1의 과발현 정도에 따라 비례함을 보았다. 이후 RAV1과 BES1에 의해 식물의 성장과 발달이 조절되는 것이 두 단백질이 같은 target 유전자군을 조절하는건지 확인하기 위해, RNA sequencing 분석을 진행했다. 이를 통해, 전반적으로는 RAV1과 BES1이 조절하는 유전자군이 다르지만, 공통으로 조절되는 84개의 유전자군이 존재함을 확인했다. 84개의 유전자는 Gene ontology 분석 결과 식물의 성장과 방어기작의 균형을 유지하는데 필요한 유전자들임을 확인했고, 종합적으로 애기장대의 두 전사인자 RAV1과 BES1이 서로의 프로모터에 직접적으로 binding하여 발현을 억제하고, 식물의 성장을 매개하는 유전자군의 발현을 조절하며 식물 성장의 균형을 맞추고 있음을 알 수 있다.
앱시스산 (abscisic acid (ABA))는 잘 알려진 식물의 스트레스 호르몬이다. ABA 신호전달 경로는 많은 연구들을 토대로 정립된 식물학에서의 주요 신호전달 기작으로 알려져 있다. 식물이 스트레스 상황하에서 내재적인 ABA의 합성이 증가하게 되면, ABA receptor인 PYR1/PYL/RCAR 에 의해 인지가 된다. ABA와 결합한 PYR1은 dimer의 형태로 존재하다가 monomer로 전환되며 탈인산화 단백질인 ABI1과 결합하게 된다. 그에 따라 ABA가 없을 때는 ABI1에 의해 억제되고 있던 OST1이 ABA가 있는 상황에서는 ABI1로부터 자유로워지며 활성을 얻게 되고, 이후의 여러 하위 기작을 인산화를 통해 진행시키며 ABA signaling을 매개한다. 앞서 본 연구실에서는 BAK1 단백질이 ABA signaling의 주요 단백질인 OST1과 결합하고 인산화 시키며 OST1의 활성을 조절하여 ABA에 의해 유도되는 기공의 닫힘 현상에서 기능한다고 보고한 바 있다.
더 나아가 BAK1의 ABA signaling에서의 기능을 확인해보기 위해 실험을 수행하였고, BAK1과 ABA receptor인 PYR1이 결합함과 결합의 정도가 ABA를 처리하였을 때 더 증가함을 확인했다. BAK1이 PYR1과 결합한 후 특이적으로 PYR1의 137번 threonine과 142번 serine을 인산화 시키는 것을 in vitro와 in vivo 실험에서 확인했다. 이 두 아미노산의 인산화가 ABA signaling을 활성화시키기 위해 필요한지 확인하기 위해, 인산화 형태를 변형시킨 phosphomimic 한 PYR1DD 형태와 phospho-dead인 PYR1AA 형태의 construct를 제작하여 후속 실험을 진행하였다. 정상 PYR1과 비교했을 때, PYR1DD는 ABA signaling을 강화시키고 PYR1AA는 ABA signaling을 지연시키는 것을 확인했다. 이러한 표현형이 형질전환 식물체에서도 재현되는지 다양한 ABA 반응 표현형을 대상으로 실험을 수행하였고, ABA를 처리했을 때 ABA에 의해 억제되는 뿌리 성장과 발아는 정상 PYR1을 과발현시킨 식물체에 비해 PYR1DD 과발현체에서 더욱 억제되고 있고, PYR1AA 과발현체에서는 억제 정도가 감소함을 확인하였다. ABA에 의해 유도되는 기공의 닫힘 현상과 유전자 발현에서도 각각의 PYR1 형질전환 식물체들은 이와 유사하게 ABA 반응성이 더 증가되거나 감소되는 표현형을 보였다. 이에 따라, BAK1에 의해 인산화 되는 PYR1의 137번 threonine과 142번 serine이 ABA signaling을 매개하는 데에 중요한 사이트라는 것을 확인했다. 이 후, 두 사이트의 인산화가 어떻게 ABA signaling을 조절하는지 확인하고자 했다. PYR1은 ABA와 결합하고 난 이후에 homodimer의 형태에서 monomer로 변환된다. 이 후, monomer 형태의 PYR1이 ABI1과 결합하는 것인데, 흥미롭게도 PYR1의 137번 threonine과 142번 serine이 인산화 되어 있을 때 monomerization이 크게 증가하는 것을 in vitro 와 in vivo 실험에서 모두 확인했다. 이와 더불어 monomerization 정도의 차이를 통해 PYR1DD는 더 많은 ABI1과 결합 할 수 있는 양상을 보이고, PYR1AA는 ABI1과의 결합이 크게 감소되는 것으로 나타났다. 마지막으로 ABI1이 PYR1과 결합함으로서 물리적으로 free해지고 활성화되는 OST1에 집중하였는데, PYR1의 두 사이트가 인산화 되었을 때 보이는 ABI1과의 강한 결합은 OST1이 더욱 활성화 할 수 있는 결과를 나타내고 있음을 확인하였다. 종합하였을 때, ABA가 증가하는 상황에서 BAK1이 PYR1의 137번 threonine과 142번 serine을 인산화시키고, 그에 따라 PYR1의 monomerization이 증가되는데 monomer 형태의 PYR1은 ABI1과의 결합이 증가되고 결과적으로 OST1이 활성을 얻게 된다. 본 연구를 통해 BAK1이 ABA signaling에서 양성조절자로서 기능하는 새로운 pathway를 보고할 수 있었다.