표제지
목차
ABSTRACT 12
제1장 서론 15
제1절 유전체 편집 기술의 개요 15
제2절 CRISPR-기반 유전체 편집 기술의 종류 18
1. CRISPR-Cas9 18
2. Base Editor 21
3. Prime editor 24
제3절 유전체 편집 기술 효율 향상을 위한 전략 27
제4절 유전체 편집 기술의 활용 분야 31
제2장 유선조직 특이적으로 활성화되는 Wap 슈퍼인핸서의 초기 활성 기전 규명 33
제1절 서론 33
1. 슈퍼인핸서의 개요 33
2. 유선조직 특이적으로 활성화되는 슈퍼인핸서 규명 38
제2절 실험 재료 및 방법 42
1. ChIP-sequencing (ChIP-Seq) 데이터 42
2. 플라스미드 구축 42
3. 세포 배양 42
4. 웨스턴 블랏 분석 43
5. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) 분석 43
6. 실험 동물 44
7. 조직병리학적 분석 49
8. Quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) 50
9. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) 분석 54
10. 통계 분석 56
제3절 결과 57
1. 유선조직 특이적으로 활성화되는 Wap 슈퍼인핸서의 구조적 특징 57
2. Wap 슈퍼인핸서에 결합하는 전사인자의 세포 내 위치 확인 59
3. Wap 슈퍼인핸서에 결합하는 전사인자의 세포 내 단백질 발현 확인 63
4. 세포유형에 따른 Wap 슈퍼인핸서 결합 전사인자 4종과 ELF5와의 단백질간 상호작용 확인 65
5. 유선조직 내 Wap 슈퍼인핸서 결합 전사인자의 위치 및 단백질 발현 확인 71
6. 유선조직 내 Wap 슈퍼인핸서 결합 전사인자 4종과 ELF5와의 단백질 간 상호작용 검증 73
7. Wap 슈퍼인핸서 돌연변이 마우스 라인 내 Wap 발현 확인 75
8. 유선조직 발달에 필수적인 전사인자 복합체 형성을 통한 Wap 슈퍼인핸서 활성화 기전 규명 81
제4절 고찰 85
제3장 만성폐쇄성 폐질환의 환경적·유전적 요인에 의한 발병기전 규명과 개인 맞춤형 치료법 제안 89
제1절 서론 89
1. 만성폐쇄성 폐질환의 개요 89
2. 만성폐쇄성 폐질환의 원인 91
제2절 실험 재료 및 방법 97
1. PM10 준비 97
2. 유전체 편집 플랫폼 구축 97
3. 세포 배양 101
4. 표현형 분석 105
5. 유전체 분석 106
6. 통계 분석 109
제3절 결과 110
1. COPD 질환 세포주 모델 구축 110
2. PM10에 의한 COPD 진행정도 평가 114
3. DSP SNP에 의한 COPD 진행정도 평가 117
4. 환경적·유전적 복합 요인에 의한 COPD 진행정도 평가 120
5. 개인 맞춤형 COPD 치료제의 필요성 규명 123
제4절 고찰 131
제4장 결론 134
참고문헌 136
국문초록 150
Table 1.1. 유전체 편집 기술의 다양한 전달 방법 30
Table 2.1. Wap 슈퍼인핸서 내 E1 인핸서를 타겟하는 gRNA 시퀀스 45
Table 2.2. CRISPR-Cas9을 사용하여 편집한 마우스의 유전자형 분석을 위한 프라이머 47
Table 2.3. RT-qPCR 분석 시 사용된 유전자 특이적 프라이머 52
Table 2.4. Semi-quantitative RT-PCR 분석 시 사용된 유전자 특이적 프라이머 53
Table 2.5. ChIP-qPCR 실험 시 사용된 Wap 슈퍼인핸서의 구성 인핸서 타겟 프라이머 55
Table 3.1. COPD의 위험성 및 증상 심화와 연관된 유전자 95
Table 3.2. 올인원 프라임 에디터를 사용하여 DSP SNP rs2076295을 유도하기 위한 gRNA 및 3' extension 염기서열 100
Table 3.3. DSP SNP 세포주 유전자형 분석을 위한 프라이머 104
Table 3.4. RT-qPCR 분석 시 사용된 유전자 특이적 프라이머 108
Figure 1.1. 유전체 편집 기술의 과거부터 현재까지의 진화와 응용 분야 17
Figure 1.2. CRISPR-Cas9의 구성 성분 및 편집 결과 20
Figure 1.3. Base editor의 종류와 구성 성분 및 편집 결과 23
Figure 1.4. Prime Editor의 구성 성분 및 편집 결과 26
Figure 2.1. 일반적인 인핸서와 슈퍼인핸서의 비교 및 슈퍼인핸서를 규명하기 위한 접근 방법 37
Figure 2.2. CRISPR-Cas9에 의해 유도된 돌연변이 마우스 라인 별 E1 인핸서내 결손 부위 48
Figure 2.3. Wap 슈퍼인핸서를 구성하는 유선조직 발달에 필수적인 전사인자들의 분포 위치 확인 58
Figure 2.4. 유선조직 발달에 필수적인 전사인자와 GFP가 함께 발현하는 재조합 플라스미드 구축 60
Figure 2.5. 유선조직 특이적 슈퍼인핸서에 결합하는 전사인자들의 세포 내 분포위치 규명 62
Figure 2.6. BiFC 분석을 위한 재조합 플라스미드 구축 및 VN- 또는 VC-단백질이 연결된 전사인자들의 단백질 발현 확인 64
Figure 2.7. 유선 상피세포주 HC11 내 in vivo 상 유선조직 발달에 필수적인 전사인자들간 상호작용 규명 66
Figure 2.8. 섬유아세포주 NIH3T3 내 in vivo 상 유선조직 발달에 필수적인 전사인자들간 상호작용 규명 69
Figure 2.9. 수유기 1일차 마우스의 유선조직에서 확인한 유선조직 발달에 필수적인 전사인자들의 발현 확인 72
Figure 2.10. In situ PLA를 통한 수유기 마우스 유선조직 내 유선발달에 필수적인 전사인자들간 상호작용 규명 74
Figure 2.11. CRISPR-Cas9을 통해 Wap 슈퍼인핸서 내 E1 단위 인핸서에 위치한 전사인자 결합부위 결손 돌연변이가 유도된 마우스 라인 모식도 76
Figure 2.12. Wap 슈퍼인핸서의 E1 단위 인핸서 내 전사인자 결합능이 결손된 마우스 라인의 Wap 유전자 및 단백질 발현 확인 79
Figure 2.13. 유선 특이적 Wap 슈퍼인핸서를 구성하는 E1, E2 및 E3 구성 인핸서의 활성 규명 82
Figure 2.14. HC11 세포에서 BiFC 분석을 통해 유선발달에 필수적인 전사인자들간의 분자 상호 작용 규명 84
Figure 2.15. 유선조직 특이적 Wap 슈퍼인핸서 모식도 88
Figure 3.1. 환경적·유전적 요인에 의해 유도되는 COPD 발병 기전 규명 96
Figure 3.2. Prime editing의 편집 효율을 높이기 위한 플랫폼 구축 98
Figure 3.3. 사람 폐 상피세포주를 사용한 DSP SNP 세포주 구축과정 102
Figure 3.4. PM10을 농도별로 처리하여 유도한 COPD 세포 모델 내 염증성 사이토카인 발현량 비교 111
Figure 3.5. DSP SNP rs2076295 유도를 통해 유전적 요인에 의한 COPD 세포주 모델 구축 113
Figure 3.6. 폐 상피세포주 A549에서 PM10이 COPD 진행에 미치는 영향 평가 116
Figure 3.7. 폐 상피세포주 A549에서 DSP SNP rs2076295이 COPD 진행에 미치는 영향 평가 118
Figure 3.8. 폐 상피세포주 A549에서 환경적·유전적 복합요인이 COPD 진행에 미치는 영향 평가 122
Figure 3.9. COPD 발병 모델에 영향을 미치는 요인에 따른 DEG 분석 125
Figure 3.10. 환경적 및 유전적 요인에 의해 유도된 COPD 세포 모델에서 COPD 발병 기전과 연관된 DEG 분석 127
Figure 3.11. 유전적 요인 특이적 COPD 발병 모델에서 나타나는 KEGG 기전 분석 130