폐경이 지난 여성에서 뇌졸중 발생률이 크게 증가하게 된다. 폐경이 지난 여성의 체내에는 에스트로겐이 부족하고 이것이 여성의 뇌졸중 발생률, 사망률, 재발률, 부작용의 발생 증가로 이어지게 된다. 뇌졸중 발생 시 뉴런에서는 다양한 작용이 중 하나인 autophagy가 일어나고 뇌졸중과 같은 스트레스에서 다양한 정도로 활성화되어 신경세포를 보호하는 역할을 한다. 따라서 본 연구에서는 여성에서 높게 발병되는 뇌졸중의 원인을 autophagy 연구를 통해 규명하고자 한다.
뇌졸중 후 에스트로겐(E2)에 의한 autophagy 반응을 작용을 연구하기 위해, aged and OVX mouse에 tMCAO를 수행하였다. 뇌경색의 개선 여부 및 뇌 조직 Western blot과 Immunofluorescence, qPCR를 통해 autophagy marker들의(LC3B, p62, LAMP1, CTSD, Transcription factor EB(TFEB), me-TFEB)의 단백질 및 mRNA 활성을 확인했다.
본 실험 결과를 통해서 E2 level 및 뇌졸중의 중증도에 따라 autophagy 반응이 다르게 나타나는 것을 알 수 있었다. 우선, 성별에 따른 뇌경색을 비교하면, female의 뇌경색 볼륨이 male보다 작았다. 뇌졸중의 중증도에 따라 비교하면, mild condition에서는 E2의 뇌경색의 개선된 것을 볼 수 있었던 반면, severe condition에서는 E2가 뇌경색이 악화되었다. young(3M) mice에서는 E2가 autophagy를 억제하는 반면, 체내에 E2 level이 적다고 생각되는 Aged (1Y) mice에서는 E2가 autophagy를 유도하는 것을 확인했다. 이것을 조직면역학적 관점으로 확인했을 때, LC3B와 LAMP1의 colocalization은 young female에서 E2 처리 시 감소하는 반면, aged female에서는 stroke 후 감소한 colocalization이 E2 처리 후 증가하는 경향을 발견했다.
여러 autophagy marker들 중 autophagy master regulator인 TFEB을 중점적으로 보았고, female에서 나이가 들수록 뇌에서 TFEB mRNA 발현이 감소했다. 또한 N2a cell의 hypoxia 그룹에서 E2 처리 시 TFEB의 mRNA 발현이 증가했다. Young female에서 TFEB 및 me-TFEB의 레벨을 확인한 결과 mild condition과 severe conition 모두에서 E2 처리 시 me-TFEB의 발현량이 증가했다. 하지만 Aged tMCAO mice에서는 TFEB과 me-TFEB의 발현 차이가 없었다. me-TFEB의 발현량을 성별에 따라 보았을 때, 조직학적으로 발현량이 다르며, striatum에서 female의 TFEB 발현량이 male보다 더 높았다.
E2와 TFEB의 interaction을 밝히기 위해 estrogen receptor(ERs)와 TFEB을 이용해 진행한 ICC 및 PLA에서 다수의 colocalization 및 red signal을 확인할 수 있었다. 이는 ER과 TFEB이 같은 프로모터에 위치해 interaction을 함을 시사한다.
E2에 의해 영향받는 자가포식 단계를 확인하기 위해 chloroquine(CQ)을 신경세포에 처리하였다. E2 처리 시 cell viability가 증가하고 immunoblot에서 E2와 CQ가 처리된 group에 LC3B가 증가한 것으로 보아 E2가 stroke 시 brain 자가포식을 촉진하고 E2가 자가포식 upstream 조절자임을 시사합니다.
따라서 E2 및 중증에 따른 TFEB의 증감으로 autophagy가 조절되고 그로 인해 뇌졸중에서의 E2에 의한 autophagy 반응을 정확히 규명하는 증거를 제공하고자 한다.