EHF 는 ETS 과에 속하는 멤버 중 하나이다. ETS 과 멤버들은 ETS 도메인이라고 알려진 DNA-binding domain 을 통해 타겟 유전자의 발현을 조절한다. 여러 연구들이 전립선암과 췌장암에서 EHF 가 종양억제유전자로 기능하는 것을 밝혔다. 그러나, 유방암에서 EHF 의 기능에 대해서는 아직 잘 알려져 있지 않다. NDRG2 는 종양억제 유전자이며, NDRG2 의 발현은 여러 암종에서 감소되어 있다. 데이터 분석을 통하여, 유방암, 특히 삼중음성 유방암에서 NDRG2 와 EHF 간에 양성 상관관계를 확인할 수 있었다. 유방암에서 EHF 의 기능에 대해 알아보기 위하여, MDA-MB-231 과 MDA-MB-453 세포에서 EHF 를 과발현시켰고, 두 세포주 모두에서 성장이 저해됨을 확인할 수 있었다. 또한 EHF 의 과발현에 의해 항암제 중 하나인 paclitaxel 에 대한 민감성이 증가함을 확인하였다. 또한 MDA-MB-231-EHF 세포도 성장이 저해되었으며 paclitaxel 에 대한 민감도가 증가되었다.
노화된 세포가 성장 저해 현상을 보이기 때문에, EHF 과발현으로 인해 나타난 성장 저해가 세포 노화와 관련이 있을 것이라는 가설을 세웠다. SA-β-gal 염색을 통하여 EHF 과발현 세포가 높은 SA-β-gal 활동성을 나타냄을 확인하였다. 또한, EHF 과발현 세포에서 노화 표지자인 p21WAF1/CIP 의 발현이 높게 나타났다. 인산화된 AMPK 또한 EHF 과발현 세포에서 증가되어 있었고, 이것을 통해 EHF 의 발현이 세포 노화와 관련되어 있음을 알 수 있었다.
여러 선행 연구 결과들은 췌장암을 비롯한 암세포의 전이 능력이 EHF 과발현에 의해 억제되는 것을 보여준 바 있다. EHF 가 과발현된 MDA-MB-231 세포의 전이 능력을 확인해보기 위해서, Transwell 을 이용한 실험을 진행하였고, 이를 통해 EHF 과발현 세포의 이동성과 침윤성이 낮아져 있는 것을 확인할 수 있었다. 상처 치유 시험에서도 MDA-MB-231 과 MDA-MB-453 세포주에서 EHF 의 과발현이 세포의 이동성을 저해시키는 것을 확인할 수 있었다. 전이 능력은 상피간엽이행과 관련이 있는 것으로 알려져 있기 때문에, 데이터셋을 이용하여 EHF 와 상피간엽이행 표지자와의 관련성을 분석하였다. 유방암 데이터셋 분석을 통하여 EHF 와 상피세포 표지자 중 하나인 CDH1 간에 양성 상관관계를 확인할 수 있었다. 반면, EHF 의 발현은 간엽세포 표지자인 Snail, Slug 와 음성 상관관계를 보였다. 삼중음성 유방암 세포주들 또한 EHF 와 CDH1 간의 양성 상관관계를, EHF 와 Snail, Slug 사이에는 음성 상관관계를 보였다. MDA-MB-231 세포주에서 EHF 과발현에 의해 형태학적인 변화가 관찰되었다. MDA-MB-231 세포는 가늘고 긴 간엽세포의 특성을 보였으나, EHF 과발현에 의해 세포는 다각형 형태로 변화하였고 세포간 상호작용이 증가된 상피세포의 특성을 보였다. MDA-MB-231-EHF 세포에서 E-cadherin 의 발현은 증가되었고 Snail 의 발현은 감소되었다. 더욱이, 일시적인 EHF 과발현에 의해서도 간엽세포 표지자는 감소되었고 상피세포 표지자는 증가하였다. 또한 MDA-MB-231-EHF 세포에서 siRNA 를 이용한 EHF 제거에 의해 간엽세포 표지자가 증가하였다.
STAT3 신호는 암의 진행을 촉진시키고, 여러 종양에서 과발현 되어있는 것으로 알려져 있다. 선행 연구는 STAT3 신호가 EMT 를 촉진한다는 것을 밝힌 바 있다. 그러므로, EHF 과발현에 의한 EMT 억제가 STAT3 신호와 관련이 있다는 가설을 세웠다. MDA-MB-231 과 MDA-MB-453 세포에서 EHF 과발현은 STAT3 의 인산화를 억제하였다. 더욱이, MDA-MB-231-NDRG2 세포에서 siRNA 를 이용한 EHF 제거는 인산화된 STAT3 의 발현을 증가시켰다. 이러한 결과들을 통해 EHF 가 STAT3 신호를 억제한다는 것을 알 수 있었다.
in vivo 에서 EHF 의 기능에 대해 알아보기 위하여, EHF 가 과발현된 4T1 세포 (4T1-EHF) 세포를 구축하였다. 이전 결과들과 유사하게, 4T1-EHF 세포는 성장 저해 현상을 보였고, 높은 SA-β-gal 활동성을 보였다. p21WAF1/CIP 의 발현 또한 4T1-EHF 세포에서 증가되어 있었다. 4T1 세포에서 EHF 과발현에 의해 세포의 전이 능력 또한 저해되었다. 더욱이, EHF 과발현은 항암제 중 하나인 doxorubicin 에 대한 민감도를 증진시켰다. In vivo 에서의 EHF 발현 효과를 검증하기 위하여 Balb/c 생쥐에 4T1-mock 과 4T1-EHF 세포를 피하주사하고 3 주 후 관찰한 결과, 종양의 크기는 4T1-mock 에 비해 4T1-EHF 의 경우에서 상당히 감소되어 있었다. 종양에서 인산화된 STAT3 와 Slug 의 발현이 4T1-mock 종양에 비해 4T1-EHF 종양에서 감소되어 있었다. 비장 비대증 또한 4T1-EHF 을 주사한 쥐에서 억제되어 있었다. 또한 4T1 세포에서 EHF 의 과발현은 유방암 세포가 폐로 이동하는 것을 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다. 실제로, 4T1-EHF 을 주사한 쥐에서 4T1-mock 을 주사한 쥐에 비해 폐결절의 수가 상당히 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이와 유사하게, 4T1-mock 혹은 4T1-EHF 세포를 정맥주사한 경우에도 같은 결과를 확인할 수 있었다. 4T1-EHF 을 정맥주사한 쥐에서는 4T1-mock 을 정맥주사한 쥐에 비해 폐결절의 수가 상당히 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과들을 통해, EHF 가 암의 진행과 전이를 억제함을 알 수 있었다. 흥미롭게도, dataset 분석을 통하여 EHF 의 발현이 종양으로 침윤된 면역 세포와 관련이 있음을 볼 수 있었고, 실제로 EHF 종양에서 CD3+ T 세포가 증가되어 있음을 보았다. 그러나 누드마우스에서 4T1-mock 과 4T1-EHF 을 피하주사 했을 때 생성된 종양의 크기가 둘 간에 큰 차이가 없었다. 더욱이, 비장 비대증 또한 4T1-EHF를 주사한 경우에 저해되지 않았다. 이 결과는 EHF 가 종양 억제자로 작용하는데 어떠한 면역 세포가 관여함을 시사하고 있다. 종양 크기는 큰 차이가 없었지만, 생성된 폐 결절의 수는 4T1-EHF 를 주사한 쥐에서 상당히 감소되어 있었다. 이를 통해 EHF가 누드마우스에서도 여전히 암세포의 전이능력을 억제함을 알 수 있었다.
다음으로, EHF 발현에 따른 Kaplan-Meier plot 을 분석해보았다. 유방암 환자에서, EHF 의 높은 발현은 재발 생존율과 전체 생존율을 증진시켰다. 항암치료를 받은 유방암 환자에서도 EHF 가 높은 경우에 재발 생존율이 더 높았다. 더욱이, 무병기간 또한 EHF 가 높은 경우에 더 길었다. 암의 TNM 병기 분류법에서, 높은 EHF 발현을 가지고 있는 환자들은 T 와 N stage 가 상대적으로 낮았다. 이러한 결과들은 유방암 모델에서 EHF 가 STAT3 신호의 억제와 세포 노화 촉진을 통해 암의 진행과 전이를 억제하는 작용을 하고 있어 결과적으로 암 억제유전자로 기능하고 있음을 보여주었다.