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SUMMARY
CONTENTS
목차
제1장 서론 16
제1절 연구 개발의 목적 16
제2절 연구개발의 필요성 18
제2장 국내외 기술개발 현황 20
제1절 국내외 관련기술의 현황과 문제점 20
제2절 앞으로의 전망 20
제3장 연구개발 수행 내용 및 결과 22
제1절 연구개발 방법 및 설계 22
제2절 연구개발 결과 37
제4장 연구개발 목표 달성도 및 대외기여도 154
제1절 연구개발 목표 및 평가의 착안점 154
제2절 연구개발 목표의 달성도 157
제3절 관련분야의 기술발전에의 기여도 160
제5장 연구개발결과의 활용계획 161
제1절 추가연구의 필요성 161
제2절 타 연구에의 응용 161
제3절 연구결과의 활용계획 162
제6장 기타 중요 변동사항 164
제7장 참고문헌 165
Table 1. Nucleotide sequence of primers used for RT-PCR of genomic segments of RBSDV 24
Table 2. Nucleotide sequence of primers used for RT-PCR of RBSDV ORF1, 2, 9 and 12 28
Table 3. Genomic features of RBSDV 55
Table 4. Predicted ORFs of RBSDV by searching at BLAST 56
Table 5. Deduced sizes of restriction endonuclease digested fragments (kb) of S1GV 63
Table 6. Genomic features of S1GV 66
Table 7. Predicted genes in S1GV 67
Table 8. S1GV genes grouped according to their function 73
Table 9. Comparison of S1GV genes with those of other baculoviruses 74
Table 10. 국내에서 수집한 바이러스시료 목록 89
Table 11. Table 2. Host reaction of seven tobamovirus isolates from crop plants 90
Table 12. 염기서열이 완료된 Tobamovirus의 분석 결과 94
표 13. 다양한 종류의 begomoviruses를 검정할 수 있는 primers 100
표 14. Begomovirus detection을 위한 designated primer 108
표 15. HYVV 탐지에 사용된 프라이머 서열과 클론 정보 109
표 16. SPLCV 탐지에 사용된 프라이머 서열과 클론 정보 110
표 17. SPLCV 전체 염기 서열 확인을 위한 시퀀싱 프라이머 111
표 18. AC2 유전자 서열 탐지를 위해 고안 된 프라이머 118
표 19. TuMV 전체 염기서열 결정을 위한 각 부분 서열의 PCR을 위해 고안 된 프라이머 120
표 20. 고안 된 프라이머 서열에 의한 표적 DNA의 PCR 증폭 부위 및 크기 121
표 21. Gateway cloning을 위하여 primary PCR product 준비를 목적으로 사용되어진 primer set 131
표 22. 목적 promoter set과 이를 위해 사용 된 primer set 및 증폭 영역 132
표 23. 바이러스 cDNA의 초기 클로닝 운반체 정보 137
표 24. 염기서열을 확인하고 NCBI(미국) 및 DDBJ(일본)의 DB에 등록한 바이러스 cDNA의 단편 30종 138
표 25. 국내 주요 작물에서 분리한 Bromoviridae와 Comoviridae바이러스의 주요 특성 143
표 26. 클로닝 및 염기서열 결정을 위하여 사용된 CMV 특이적 primer 144
표 27. 클로닝 및 염기서열 결정을 위하여 사웅된 TAV의 특이적 primer 145
표 28. 국내에서 분리한 Bromoviridae와 Comoviridae바이러스의 염기서열 분석 현황 146
표 29. 감염성 클론의 제작현황 148
표 30. CMV-Ab2의 기주반응 149
표 31. CMV-Ly2의 기주범위 특성비교 151
Fig. 1. RT-PCR and cloning strategy of the genomic segments of the Rice Black Streaked Dwarf Virus. Solid arrow and line indicate primer positions used in RT-PCR amplification and amplified region, respectively. 26
그림 2. 감염성클론의 제작모식도 31
그림 3/11. 한국 농업미생물 보존센터에 기탁한 시료의 예.... 37
그림 4/12. 바이러스 클론 및 감염시료들의 기탁증명서. 38
그림 5/13. ZYMV 분리주 310과 Z06의 병징 39
그림 6/14. ZYMV 염기서열 분석을 위한 primer 디자인 39
그림 7/15. ZYMV의 전체 게놈정보를 기초로 파악된 polyprotein의 아미노산 서열 정보를 이용한 기 보고된 ZYMV isolate들과의 분류학적 근연관계. 39
그림 8/16. ZYMV 전체 염기서열을 기초로 한 phylogenetic tree 40
그림 9/17. PVY의 P1 단백질 부분의 아미노산 서열 정보를 이용한 기보고된 PVY isolate들과의 계통 분류학적 근연관계. 40
그림 10/18. 담배에 발생하는 PepMoV 병징 패턴 41
그림 11/19. PepMoV 염기서열 분석을 위한 primer 디자인 41
그림 12/20. PepMoV의 게놈정보를 이용한 기 보고된 PepMoV와의 계통 분류학적 근연관계. 42
그림 13/21. 전체 염기서열을 기초로 한 phylogenetic tree 42
그림 14/22. SMV 전체 염기서열 분석을 위한 primer 디자인 42
그림 15/23. SMV 전체 염기서열에 기초한 phylogenetic tree 43
그림 16/24. SMV 전체 아미노산 서열에 기초한 phylogenetic tree 43
그림 17/25. SMV P1 단백질의 phylogenetic tree 44
그림 18/26. SMV HC-pro 단백질의 phylogenetic(phygenetic) tree 44
그림 19/27. SMV P3 단백질의 phylogenetic tree 44
그림 20/28. SMV C1 단백질의 phylogenetic tree 45
그림 21/29. SMV NIb 단백질의 phylogenetic tree 45
그림 22/30. SMV CP 단백질의 phylogenetic tree 45
그림 23/31. SMV HC-pro 유전자의 염기서열에 기초한 phylogenetic(phygenetic) tree 47
그림 24/32. pSNU1 및 pSNU2 벡터의 모식도 48
그림 25/33. 감염 가능한 PVX 클론들과 분자 표지 클론의 모식도 48
그림 26/34. PVX DNA 클론의 병징 패턴 49
그림 27/35. RT-PCR을 이용한 PVX 와피 단백질의 검출 49
그림 28/38. in vitro transcription을 통한 full length RNA의 발현이 가능한 CGMMV 클론의 모식도. 50
그림 29/37. Yeast two-hybrid system을 이용한 SMV 바이러스 단백질간의 상호작용 screening(작물유전체 연구사업 지원) 51
그림 30/38. mPZP212 과발현 벡터의 모식도 52
그림 31/39. mPZP212 과발현 벡터를 이용한 GFP의 과발현 52
그림 32/40. GFP와 fusion된 WIPK의 과발현. 53
그림 33/41. Graphical representation of the gene distribution from(fro) each RBSDV genomic segment. 55
그림 34/42. Amino acid sequence alignment of the ORF1 from RBSVD and RNA-dependant RNA polymerase from MRCV, Cypovirus and FDV. The most variable region was shaded with gray color. 57
그림 35/43. Amino acid sequence alignment of the ORF2 from RBSVD and major core protein from MRCV and FDV. The most variable region was shaded with gray color. 58
그림 36/44. Amino acid sequence alignment of the ORF9 from RBSVD and NTP binding protein from MRCV. 58
그림 37/45. Amino acid sequence alignment of the ORF12 from RBSVD and major outer shell protein from MDV. 59
그림 38/46. Schematic diagrams of recombinant AcNPVs expressiong fusion protein of polyhedrin and RBSDV ORFs. 59
그림 39/47. Sf9 cells infected with recombinant AcNPVs expressiong fusion protein of polyhedrin and RBSDV ORFs. 60
그림 40/48. SDS-PAGE analysis of polyhedra produced by recombinant AcNPVs expressing fusion protein of polyhedrin and RBSDV ORFs. 60
그림 41/49. SDS-PACE analysis of fusion protein of polyhedrin and RBSDV ORFs electro-eluted from polyhedral proteins expressed by recombinant AcNPVs.... 61
그림 42/50. Cleavage patterns of S1GV genomic DNA using the restriction endonuclease, BamHI, EcoRI, HindIII and PstI.... 62
그림 43/51. Nucleotide sequence of the granulin gene of S1GV and the deduced amino acid sequences which are indicated with one-letter code designations (GenBank Accession No. DQ288858). 64
그림 44/52. Phylogenic relationship of the S1GV granulin gene and the other granulin genes and polyhedrin genes based on nucleotide sequences 65
그림 45/53. Genomic organization of S1GV. 66
그림 46/54. Genomic sequence comparison of S1GV with AoGV, AsGV, C1GV, CoGV, CpGV, PoGV, PxGV and XcGV, by dot plot matrix analysis. 76
그림 47/55. 지역별 바이러스의 선발 77
그림 48/56. 포장 사진 및 전자현미경 검정 결과 78
그림 49/57. 생물검정 결과 78
그림 50/58. TBSV-tomato 전체 게놈 분석 결과 79
그림 51/59. 염기서열 분석 80
그림 52/60. 염기서열 분석 80
그림 53/61. 염기서열 분석 81
그림 54/62. Carnation mottle virus-CP amono acid sequence의 covariation 81
그림 55/63. 염기서열 분석 81
그림 56/64. Carnation mottle virus 프라이머 제작 82
그림 57/65. Melon necrotic spot virus 프라이머 제작 82
그림 58/66. GALV와 TBSV의 전 염기서열 분석 및 병징 83
그림 59/67. GALY와 TBSV 병원성 검정 84
그림 60/68. GALV와 TBSV 세포학적 검정 결과 84
그림 61/70. GALV와 TBSV 제놈 분석 결과 85
그림 62/71. GALY와 TBSV 병원성 관여 유전자 분석(A) 및 CarMV, MNSV, TBSV 및 GALV 유전적 변이 분석(B) 86
그림 63/72. 작물 바이러스의 국가 종합 관리 체계 구축 DB 86
그림 64/73. 야외포장에서 수집된 박과감염 Tobamovirus의 병징패턴 88
그림 65/74. 감귤에 발생하는 바이러스 병징 패턴 88
그림 66/75. 감귤시료로부터 CTV의 RT-PCR검정Lane M,1kb; Lane1-10,collected citrus samples 90
그림 67/76. 수집한 몇몇 Tobamovirus의 기주에서의 병징패턴 91
그림 68/77. 감염식물체로부터 tobamovirus 게놈RNAs의 전기영동패턴.... 91
그림 69/78. 감염식물체로부터 Tobamoviruses의 Multiplex RT-PCR 검정.... 92
그림 70/79. BpeMV와 MarMV의 다른 Tobamovirus와의 유연관계 분석.... 93
그림 71/80. Maracuja mosaic virus의 감염성클론 제작 95
그림 72/81. 전장의 MarMV cDNA 클론으로부터 감염성 확인 95
그림 73/82. 바이러스벡터를 이용한 GFP유전자의 식물체내 발현 96
그림 74/83. 바이러스벡터의 활용성을 위한 작물에서의 유전자발현패턴 96
그림 75/84. 한국에서 제미니바이러스를 분리하기 위한 field survey. 토마토 온실에서 많은 수의 whitefly가 관찰되었던 순천을 중심으로한 전라지역 및 거제를 중심으로 한 경상지역을 조사. 부여군에서는 whitefly가 관찰되는 파프리카 온실을 조사. 98
그림 76/85. HYVV에 감염된 토마토 재배 온실과 감염된 토마토와 유사한 병징을 나타내는 온실 주변의 콩과 식물.... 99
그림 77/86. 바이러스에 감염된 것으로 보이는 유리 온실 주변의 식물.... 99
그림 78/87. 제미니바이러스에 감염되는 것으로 알려진 원예종. 99
그림 79/88. Uni-primer를 이용한 제미니바이러스의 검정 100
그림 80/89. Rojas 및 Brown primer sets를 이용한 제미니바이러스의 검정 101
그림 81/90. Deng 및 RLG primer sets를 이용한 제미니바이러스의 검정 101
그림 82/91. 전체 염기서열 분석을 위한 PCR과 제미니바이러스의 검정 101
그림 83/92. 다양한 priemrs를 이용하여 얻은 PCR products의 cloning 102
그림 84/93. Genomic southern을 이용한 제미니바이러스의 검정 102
그림 85/94. 국내 분리 바이러스의 변이 정도. core region은 보존되고 있으나 기타 부위의 변이는 높음. 103
그림 86/95. Honeysuckle yellow vein virus (HYVV)의 구조와 상동성 비교. ORF의 amino acid sequences와 intergenic region (IR)의 nucleotide sequences를 다른 begomoviruses와 비교. 104
그림 87/96. 전체 염기서열에 기초한 phylogenetic tree. 국내에서 분리한 것은 Korea isolate로 표시. monopartite genome을 갖는 begomovirus 가운데 토마토에서 분리한 isolates와 비교. 104
그림 88/97. 제미니바이러스에 의해 감염된 증상을 보이는 국내산 무늬인동과 일본산 무늬인동.... 105
그림 89/98. 잎말림과 옆맥 팽창의 증상이 제미니바이러스 감염에 의한 것으로 의심되는 고구마 샘플.... 105
그림 90/99. Lonicera japonica로부터 전자 현미경 (TEM)에 의한 제미니바이러스의 crystalline inclusion 확인.... 106
그림 91/100. Lonicera japonica의 접붙임 과정 모식도 107
그림 92/101. L. japonica의 접목 과정 각각에서 HYYV의 PCR 검출 및 Sothern blotting에 의한 검출 107
그림 93/102. HYVY 탐지용 프라이머의 디자인 및 전체 genome의 클로닝 전략 109
그림 94/103. SPLCV 탐지를 위한 프라이머 디자인 및 전체 genome의 클로닝 전략 110
그림 95/104. SPLCV 서열 확인을 위한 시퀀싱 프라이머의 디자인 111
그림 96/105. 서열 확인 된 제미니바이러스의 genome과 참고 서열 유전자 지도의 비교 112
그림 97/106. HYVV 염기 서열로부터 유추된 각 ORF의 아미노산 서열과 참고 서열 (NC_005807)간의 서열 정렬 113
그림 98/107. SPLCV 염기 서열로부터 유추된 각 ORF의 아미노산 서열과 참고 서열 (NC_O04650)간의 서열 정렬 114
그림 99/108. 서열 정렬을 통한 Korean type HYVV와 SPLCV의 계통유전학적 분석. 115
그림 100/109. HYVV의 감염 가능한 클론 제작 과정 모식도 115
그림 101/110. SPLCV의 감염 가능한 클론 제작 과정 모식도 116
그림 102/111. HYVV의 각 클론을 확보하기 위한 PCR 결과 116
그림 103/112. 각 산물을 이용한 2 mer를 만들기 위한 HYVV 1 mer와 1.3 mer를 SnaBI digestion 결과 116
그림 104/113. HYVV dimer로 확인 된 클론의 colony PCR 확인 결과 117
그림 105/114. SPLCV로부터 감염 가능한 클론의 제작을 위한 vector 및 insert의 준비 117
그림 106/115. PROSITE 단백질 데이터베이스에서 SPLCV의 AC2 유전자의 bipartite nuclear targeting sequence motif 예측 결과 118
그림 107/116. Korean type SPLCV와 HYVV로부터 AC2 ORF의 PCR 증폭 결과 118
그림 108/117. 참고문헌 비교에 따른 HYVV C2 유전자의 nuclear localization sequence (NLS)와 Zinc-Finger motif의 확인. 119
그림 109/118. 참고문헌 비교에 따른 SPLCV AC2 유전자의 nuclear localization sequence (NLS)와 Zinc-Finger motif의 확인. 119
그림 110/119. 고안 된 프라이머를 이용한 TuMV NO strain으로부터 RT-PCR (위)및 gradient PCR (아래)에 의한 표적 DNA의 RT-PCR 증폭 결과 121
그림 111/120. 고안 된 프라이머를 이용한 TuMV CG strain으로부터 표적 DNA의 RT-PCR 증폭 결과 122
그림 112/121. TuMV NO, CG strain과 참고 서열간의 polyprotein 단백질 서열 정렬 123
그림 113/122. TuMV NO, CG strain의 coat protein 서열 비교 124
그림 114/123. TuMV coat protein의 계통유전학적 분석. 124
그림 115/124. HYVV의 infectious clone 제작 모식도 125
그림 116/125. SPLCV의 infectious clone 제작 모식도 126
그림 117/126. Infectious clone을 이용하여 감염한 식물로부터 geminvirus 감염 증상의 확인 및 southern hybridization 분석을 통한 제미니바이러스 replication의 확인 127
그림 118/127. 증상을 보이는 조직의 전자현미경 관찰에 의한 virus inclusion의 확인 127
그림 119/128. TGMY AL2 아미노산 서열 정렬을 통한 HYVV와 SPLCV AC2의 suppressor 기능 예측 128
그림 120/129. AC2 유전자의 식물 형질전환 벡터 pBI121내 클로닝 모식도 129
그림 121/130. GFP 발현에 따른 AC2 유전자에 의한 Posttranscriptional gene silencing activity와 대조군 (P19, GUS)의 비교 129
그림 122/131. 제미니바이러스 AC2 유전자간의 amino acid 조성 비교를 통한 conserved sequence의 파악. 130
그림 123/132. 제미니바이러스 intergenic region의 oriention에 따른 virion sense 및 complementary sense의 promoter analysis를 위한 vector construct scheme. 131
그림 124/133. 1st PCR과 2nd PCR을 통해 homologous recombination site를 양 말단에 가진 promoter deletion set의 증폭 132
그림 125/134. PCR product와 homologous recombination 방법으로 cloning하기 위해서 일반적으로 사용하는 entry cloning vector 133
그림 126/135. Promoter analysis에 적합한 promoter region deleted Gus-Gfp fusion gateway plant expression vector pBGWFS7 134
그림 127/136. 농업생명공학연구소 홈페이지(2007년 12월에 추가 보완 완료, 적색부분 : 바이러스 DB) 135
그림 128/137. 바이러스 DB의 구성 및 내용 136
그림 129/138. ZYMV-A 계통의 유전자 구조해석 결과 139
그림 130/139. ZYMV-A 계통의 potyvirusso에서의 유연관계 분석결과 139
그림 131/140. CMV RNA1, 2와 RNA3와의 조합(좌)과 담배와 호박에서의 병징차이(우) 140
그림 132/141. CMV MP에서의 아미노산 서열 치환에 따른 병징발현 요인분석 140
그림 133/142. gfp 유전자가 재조합된 TMV(아래) 및 gfp 형질전환 식물체에 감염결과(위) 141
그림 134/143. TMV-gfp infectious cDNA의 감염에 따른 바이러스의 기주식물체내 이동현상 분석 141
그림 135/144. CMV RNA1, 2 및 3의 염기서열을 기초로한 CMV 계통간 유연관계 분석 147
그림 136/145. CMV-PepY 감염성 클론으로부터 전사시킨 RNA의 전기영동 사진 148
그림 137/146. CMY-Ab2를 접종한 담배(N. tabacum cv. Burley21)(좌)에서의 병징 비교 149
그림 138/147. 고추에 CMV-Ab2를 접종하고, 10일 후 CMV-Mf를 접종한 고추와 CMV-Mf만을 접종한 고추의 병징 비교 150
그림 139/148. 고추에 CMV-Ab2를 접종하고, 10일 후 CMV-Mf를 접종한 고추(좌)와 CMV-Mf만을 접종한 고추(우)의 생육 비교 150
그립 140/149. CMV-Ly2를 접종한 N. tabacum cv. Xanthi-nc의 접종엽(a) 및 상엽(b)의 병징 151
그림 141/150. CMV-Ly2를 접종한 N. tabacum cv. Xanthi-nc상엽의 immuno tissue-blotting 152
그림 142/151. CMV PepY 및 Paf satRNA의 염기서열 152
그림 143/152. 카메라 cDNA에 대한 double-joint mutation 처리 후 Fny-CMV와 함께 접종한 고추에서의 병징 변화 152
그림 144/153. PepY satRNA와 Paf satRNA의 키메라 cDNA construction과 기주반응 153