표제지
제출문
보고서 초록
요약문
Summary
CONTENTS
목차
제1장 연구개발과제의 개요 25
1. 연구 개발의 목적 25
2. 연구 개발의 필요성 25
가. 경제, 사회적 측면 25
나. 기술적 측면 26
다. 사회·문화적 측면 27
3. 연구 개발의 범위 28
가. Lentivirus system을 이용한 유전자 전달 시스템의 확립 28
나. 세포내에서의 shRNA hAIMP2-DX2의 항암효과 검증 28
다. 폐암 모델 마우스에서의 shRNA mAIMP2-DX2의 항암효과 검증 28
제2장 국내외 기술개발 현황 29
1. 국내외 기술개발현황 29
가. 외국의 경우 29
나. 국내의 경우 30
다. 조사연구개발사례에 대한 평가 31
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 33
제1절 Lenti-virus system을 이용한 유전자 전달 시스템의 확립 33
1. 서론 33
2. 재료 및 방법 33
3. 결과 및 고찰 37
(1) Lenti-virus GFP 발현 확인 37
(2) hAIMP2와 hAIMP2-DX2 유전자를 포함한 lenti-virus 합성 38
(3) 합성된 lenti-virus의 검증 44
(4) hAIMP2-DX2에 대한 shRNA를 포함한 lenti-virus 합성 47
(5) hAIMP2-DX2 target shRNA를 발현하는 lenti-virus의 검증 실험 49
4. 요약 50
제2절 세포내에서의 hAIMP2-DX2의 항암효과 검증 51
1. 서론 51
2. 실험재료 및 방법 52
3. 결과 및 고찰 55
(1) 다양한 폐암 세포주에서 hAIMP2-DX2의 발현 양 확인 55
(2) 다양한 폐암 세포주로부터 EGFR의 발현 양 확인 56
(3) hAIMP2-DX2 target shRNA 처리에 의한 단백질 발현 감소 확인 57
(4) shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 Glucose Transporters (Gluts) 발현 양 58
(5) Glucose 처리에 의한 O-glycosylation 증가 59
(6) shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 Glycosyltransferase (GnT) 발현 양 61
(7) Glucose 처리에 의한 EGFR 증가 63
(8) shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 MAPK signaling pathway 관련 단백질의 감소 65
(9) shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 단백질 번역 (translation)의 감소 67
(10) shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 세포 증식의 감소 68
(11) hAIMP2-DX2와 연관된 Signaling Pathway 모식도 69
4. 요약 70
제3절 폐암 모델 마우스에서의 mAIMP2-DX2의 항암효과 검증 71
1. 서론 71
2. 재료 및 방법 72
3. 결과 및 고찰 75
(1) mAIMP2-DX2에 대한 shRNA를 포함한 lenti-virus target sequence 75
(2) mAIMP2-DX2에 대한 shRNA를 포함한 lenti-virus 효과 검증 75
(3) shRNA mAIMP2-DX2 shRNA가 lung cell hyperplasia에 형성에 미치는 영향 확인 77
(4) shRNA mAIMP2-DX2 shRNA가 Akt의 활성화에 미치는 영향 79
(5) shRNA mAIMP2-DX2 가 Akt-related protein 의 활성화에 미치는 영향 81
(6) shRNA mAIMP2-DX2 가 protein translation 에 미치는 영향 83
(7) shRNA mAIMP2-DX2 가 VEGF의 활성에 미치는 영향 84
4. 요약 85
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 86
1. 목표달성도 86
2. 관련분야 기여도 86
제5장 연구개발결과의 활용계획 90
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 91
제7장 참고문헌 94
표 1. Human의 AIMP2 합성을 위한 primer 38
표 2. Human의 AIMP2-DX2 확인을 위한 primer 45
표 3. Human의 hAIMP2-DX2에 대한 shRNA target 서열 47
표 1. Mouse의 mAIMP2-DX2에 대한 shRNA target 서열 75
Table 1. shRNA mAIMP2-DX2 처리에 의한 lung cancer hyperplasia에 대한 영향.... 78
표 1. Virus 질환, 암, 유전자질환의 원인유전자에 해당하는 RNAI 적용 예 93
제1절 Lenti-virus system을 이용한 유전자 전달 시스템 확립 33
그림 1. Lenti-virus system을 이용한 형광발현유전자(GFP)의 발현... 37
그림 2. NCI-H460으로부터의 total RNA(A) hAIMP2 primer를(prmer를) 이용한 RT-PCR(B) 38
그림 3. Cloning vector pENTR 1A와 hAIMP2와 hAIMP2-DX2의 cloning... 39
그림 4. 삽입된 유전자 확인을 위한 PCR... 39
그림 5. 유전자의 발현을 위한 vector(A)와 재조합 형질 전환 된 plasmids(B)... 40
그림 6. hAIMP2(A)와 hAIMP2-DX2(B) 유전자의 상동성 분석 41
그림 7. RT-PCR에 의한 hAIMP2와 hAIMP2-DX2 유전자의 과 발현 확인 44
그림 8. hAIMP2-DX2의 발현량 확인... 45
그림 9. Western blot에 의한 hAIMP2 단백질의 과발현 확인 46
그림 10. Cloning vector pENTR/U6과 hAIMP2-DX2 siRNA cloning한 plasmids... 47
그림 11. siRNA 발현을 위한 vector와 재조합 형질 전환 된 plasmids... 48
그림 12. RT-PCR에 의한 hAIMP2-DX2 유전자의 감소 확인... 49
그림 1. 다양한 폐암 세포주로부터 hAIMP2-DX2의 발현 양 확인... 55
그림 2. 다양한 폐암 세포주로부터 EGFR의 발현 양 확인 56
그림 3. shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 단백질 발현 감소... 57
그림 4. shRNA hAIMP2-DX2 처리 후 Gluts의 발현 양... 58
그림 5. Glucose 처리에 의한 O-glycosyiation 증가.... 60
그림 6. shRNA hAIMP2-DX2 처리 후 GnT의 발현 양.... 62
그림 7. Glucose 처리에 의한 EGFR 증가.... 64
그림 8. shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 MAPK signaling pathway 관련 단백질의 변화.... 65
그림 9. shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 luciferase activity 감소 67
그림 10. shRNA hAIMP2 처리 후 Ki-67의 발현 양... 68
그림 11. hAIMP2-DX2와 연관된 Signaling Pathway 모식도 69
그림 1. shRNA mAIMP2-DX2 처리에 의한 DX2 발현양의 확인.... 76
그림 2. shRNA mAIMP2-DX2 처리에 의한 Akt 발현양의 확인.... 79
그림 3. shRNA mAIMf2-DX2 처리에 의한 Akt 관련 pathway 확인.... 81
그림 4/3. shRNA mAIMP2-DX2 처리에 의한 protein translation관련 pathway 확인.... 83
그림 5/3. shRNA mAIMP2-DX2처리에 의한 VEGF의 발현양 확인.... 84