표제지
제출문
보고서 초록
요약문
SUMMARY
CONTENTS
목차
제1장 연구개발과제의 개요 9
제1절 연구개발의 목적 9
제2절 연구개발의 필요성 9
1. 기술적 측면 9
2. 경제.산업적 측면 10
3. 사회.문화적 측면 11
제3절 연구개발의 범위 12
제2장 국내외 기술개발 현황 13
제1절 국내외 관련 기술개발 현황 13
1. 비피더스에서 vector의 개발 13
2. Food-grade 벡터 구성을 위한 비피더스 유래의 유전자 연구 14
3. Bifidobacterium의 부착능 및 표면 단백질 14
4. 비피더스균을 이용한 암세포 표적 delivery 기술개발 14
제2절 본 연구진의 연구개발기술현황 및 의의 15
1. 비피더스 발현 벡터 연구 16
2. 로타바이러스 관련된 선행연구결과 요약 17
3/4. 현기술상태의 상황 19
4/5. 앞으로의 전망 20
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 22
제1절 이론적 실험적 접근방법 22
1. 비피더스 고효율 발현 및 분비 시스템 개발 22
2. 대장균 고발현 시스템을 이용한 대량생산 및 활성화 연구 22
3. 조절 매커니즘 분석 22
4. BORI 단백질의 작용 매커니즘 규명 23
5. VP8과 함께 발현(synergy) 23
6. BORI의 안정적 발현 및 food grade 23
7. BORI균주를 활용한 제품화 24
제2절 연구내용 및 결과 25
1. 비피더스 유래의 16S rRNA promoter를 이용한 벡터 개발 및 외래 유전자 발현 25
2. 비피더스 발현시스템의 형질전환효율 증진 : Restriction-Modification system 28
3. 대장균에서 BORI 발현 30
4. 비피더스에서 BORI 발현 34
5. BORI 정제 및 활성평가 35
6. BORI 작용 mechanism 연구 37
7. B. longum BORI로부터 BORI의 정제 41
8. Effect of pH and temperature on dipeptidase activity 42
9. Substrate specificity 42
10. pepD의 상동성분석 45
11. Cell free expression을 이용한 partial dipeptidase의 발현 48
12. VP8의 cloning 51
13. B. longum BORI를 이용한 식품 소재의 제조 및 항 로타바이러스 활성 평가 55
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 57
제1절 연구개발 목표의 달성도 57
제2절 관련분야의 기술발전에의 기여도 58
가. 연구개발성과의 질적 우수성 58
제5장 연구개발결과의 활용계획 60
제1절 타 연구에의 응용 및 파급효과 60
1. 타 연구에의 응용 60
2. 연구성과의 파급효과 60
제2절 기업화 추진 방안 61
1. 기술이전 61
2. 향후 실용화 및 활용계획 61
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 63
제1절 기술의 개요 및 주요내용 63
제2절 기술개발 동향 63
1. 프로바이오틱스 게놈 연구 63
2. 프로바이오틱스 기능성 연구 65
3. 주요 경쟁기업 및 최근 업체 동향 67
제3절 환경변화 67
제7장 참고문헌 69
표. 투약군과 대조군의 특성 18
Table 1. Comparison of transformation efficiency according to the plasmid origin 30
Table 2. Summary of puriffication of the rotavirus infection Inhibitory protein from B. longum MG1 36
Table 3. Rotavirus infection inhibition mechanism of BORI protein 40
Table 4. Purification of the dipeptidase from Bifidobacterium longum BORI. 41
Table 5. Substrate specifcity of the dipeptidase purified from Bifidobacterium longum BORI 44
Table 6. Multiple sequence alignment of the first β-hairpin motif in the PVA/U34 family and other Ntn hydrolases.... 47
Table 1. Summary of genome sequending of food lactic acid bacteria and some other industrially used food bacteria 64
Fig. 1. BORI 단백질의 in vitro 활성 평가 17
Fig. 2. 대장균에서 over expression 후 FPLC 후 분리정제된 BORI 단백질의 SDS-PAGE 17
Fig. 1. The sequence and the structure of the promoter region of 16S rRNA of B. longum MG1.... 25
Fig. 2. 3'- sequence of 16S rDNA from several species of Bifidobacteriurn. 26
Fig. 3. Genetic map of the expression vector pBES16P-CHOL.... 27
Fig. 4. Growth and the enzyme activity.... 28
Fig. 5. Elcetrophoretogram of pYBamy59 from MG1 and DH5α treated with cell extract of MG1 and DH5α, respectively. 29
Fig. 6. Schematic diagram of pBAD-pepeD+His. 31
Fig. 7. SDS PAGE data of purified His-tag pepD protein.... 31
Fig. 8. MALDI-TOF data of purified pepD-his protein from E. coli. 32
Fig. 9. Schematic diagram of pBAD-pepD. 33
Fig. 10. SDS PAGE data of pepD without His-tag. 33
Fig. 11. Schematic diagram of pBES16PR-pepD. 34
Fig. 12. pepD inhibits the growth of E. coli DH5α. 35
Fig. 13. Purification of BORI protein.... 36
Fig. 14. Rotavirus infection inhibitory activities of recombinant BORI protein.... 38
Fig. 15. Rotavirus infection inhibitory activities of BORI protein from B. longum BORI. 39
Fig. 16. SDS-PAGE analysis of the fraction containing dipeptidase obtained after chromatography on Q-Sepharose (lane 2) and molecular mass standards (lane 1). 41
Fig. 17. Effects of environmental conditions on the activity of the purified dipeptidase from Bifidobacterium longum BORI determined on Ala-Gln.... 43
Fig. 18. Autosplicing model of pepD from B. longum MG1 48
Fig. 19. Partial sequence of pepD(pepDP) from B. longum BORI 48
Fig. 20. Cloning of partial pepD into pEU to construct pEU+pepDP... 49
Fig. 21. in vitro translation of pEU+ pepDP... 50
Fig. 22. in vitro translation of rRNA from pepDP.... 51
Fig. 23. Partial DNA and amino acid sequence of VP4 gene for human rotavirus Wa.... 52
Fig. 24. Cloning of rotavirus coat protein VP8 into pUC19. 54
Fig. 25. Formation of curd during yogurt fermentation using B. longum BORI 55
Fig. 26. pH change during yogurt fermentation using BORI. 55
Fig. 27. Rotavirus infection inhibitory effect of yogurt made of B. longum BORI 56