SMAD4(Mothers against decapantaplegic homologue 4) 는 염색체 18q21.1에 위치한 대표적인 암 억제 유전자로써 췌장암에서 처음 발견되었다. 췌장암과 결장암에서 SMAD4의 유전자 변이로 인하여 발현이 억제되어있다고 연구되고 있으며 유방암, 식도암, 위암에서도 SMAD4 유전자의 변이가 관찰되고 있는 것으로 보아 암의 생성과 전이의 작용 메커니즘에 대한 SMAD4의 역할에 대한 관심이 더욱 높아지고 있다.
본 실험의 목적은 새로운 방법을 이용한 SMAD4 interaction partner를 찾아서 SMAD4의 새로운 기작을 밝히는 동시에 사람 위암 세포주에서 SMAD4 프로모터 활성과 그 활성을 조절 하는 중요 전사인자에 관한 기능을 연구하고자 하였다.
Protoarray라는 방식을 이용하여 새로운 candidates를 확보하기 위해 Gateway 방법을 이용하여 사람 SMAD4를 cloning하였고, Baculovirus system을 이용하여 대량 복제시킨 후 purify하여 SMAD4 protein을 얻었다. 이후 protoarray chip을 구입하여 purified-SMAD4를 binding 시키고 assay를 통한 결과분석으로 18종의 candidates를 확보하였다. 이 중 4종은 이미 알려진 SMAD4 partner이기에 나머지 14종을 가지고 결과를 검증하였다. 검증방법은 BiFC(Bimolecular Fluorescence Complementary) assay를 이용한 것인데 이 방법은 live cell에서 형광현미경을 통하여 결과를 분석할 수 있다는 장점이 있다. 결과 14종의 protein 중에서 7종이 SMAD4의 새로운 interaction partner로 확인이 되었고, 그 중 3종의 대하여 molecular biology approach를 통한 functional study를 수행하였다. 1) FaRN1*의 경우 SMAD4와 직, 간접적으로 영향을 끼치고 있음이 우리의 이번 연구를 통하여 새롭게 밝혀졌고 이 사실은 2차년도에 보고된 우리 연구진이 발표한 논문에 dysplasia 단계까지 SMAD4 level은 증가되고 증가된 SMAD4에 의한 tumor suppression effect를 antagonizing함으로서 cancer promoting gene의 역할을 수행함이 밝혀졌다. 2) F2ITE*의 경우는 SMAD4와 같은 tumor suppression genes를 억제시키고, COX-2와 같은 preimflammation enzyme을 증가시킴으로 인해 carcinogenesis에 영향을 줄 가능성이 있는 cancer promoting gene임을 우리 연구를 통해 처음 밝혀냈고, 이와 같은 새로운 사실로 인해 F2ITE와 관련된 연구에 박차를 가하는 발판을 마련하였다. 3) KiAA* 연구를 통해서는 TGFβ의 tumorigenesis에 있어서 상반된 역할에 대한 설명을 제시하였으며 두 protein의 양적 변화에 따라 각각 다른 결과를 초래함을 밝혔다.
SMAD4의 활성 조절과 관련된 연구는 SMAD4 프로모터의 deletion 된 form을 이용하여 위암 세포주에서 기본적인 활성도를 관찰하고 활성이 현저히 감소하는 위치를 찾았다. 그 위치를 중심으로 전사조절인자 탐색 프로그램을 이용하여 몇 개의 후보 인자를 찾고 그 후보인자를 위암세포주에 Transfection 하여 SMAD4의 mRNA 발현 정도를 관찰하고 SMAD4의 발현에 영향을 주는 후보인자 SSM*을 선정하였다. SSM에 의해 SMAD4의 mRNA와 단백질의 발현이 증가됨을 Real time-PCR, Western blot을 통하여 확인하였고, SMAD4 프로모터의 활성 또한 SSM에 의해 증가됨을 Luciferase assay를 통하여 확인하였다. 또한, 실질적으로 SSM이 SMAD4 프로모터에 결합함을 EMSA를 통하여 확인하였다. 이를 통하여 위암세포주에서 SSM에 의하여 SMAD4의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다. 따라서 위암세포주에서 SSM은 SMAD4 프로모터에 결합하여 SMAD4의 발현을 조절하는 중요한 전사인자라는 것을 밝혀내었다.