정상적인 배아발달은 정교하게 조절되는 유전자 발현 프로그램에 의해 이루어지며, 이것은 세포 특이적 전사 조절인자와 크로마틴 단백질들에 의해 수행된다. 호메오박스 유전자는 대표적인 세포 특이적 전사 인자 가운데 하나로 세포의 생장 및 분화를 조절할 뿐만 아니라 나아가 조직의 발달과 형태의 형성에 있어서도 필수적인 역할을 하는 대표적인 발생조절인자이다. 이러한 조절인자들의 비정상적인 발현과 조절 체계의 이상은 선천성 질환의 주요 원인으로 알려져 있으며, 최근에는 다양한 암의 발생의 한 원인으로도 생각되고 있다. 본 연구 개발과제는 난소표면상피세포 (Ovarian Epithelial Cell)에서 발현되는 것으로 알려진 homeobox 유전자들 가운데, Msx1과 Barx2 homeobox 유전자의 기능을 이들과 세포 내에서 상호작용하는 단백질들과의 상호작용을 중심으로 그 기능을 분자 수준에서 규명하고, 그 상호작용이 난소암 발생 및 생장에 미치는 효과를 밝히는 것을 목표로 수행되었다. 또한, 호메오박스 유전자의 조건부 유전자 결손 동물모델을 개발하여 이들의 결손이 난소암의 개시 및 전이에 미치는 영향을 in vivo 수준에서 규명하고자 하였다.
본 연구과제는 먼저, Mass spectrometric analysis를 이용하여 Msx1과 Barx2 호메오단백질과 상호작용하는 세포 내 단백질들을 분리 확보하였다. 이를 위해 epitope로 표지된 두 유전자를 과발현 시킨 후 면역침강법을 이용하여 단백질 복합체를 부분 정제한 후 프로테오믹스를 통해 두 호메오단백질 복합체의 구성 요소들을 밝히고자 하였으며, Yeast Two Hybrid screening도 함께 수행하여 Mass spectrometric analysis의 문제점을 보완하고자 하였다. 그 결과, Msx1의 경우 기존에 보고되었던 linker histone H1b와 PIAS1 SUMO ligase이외, YB1, PARP, 그리고 단백질의 유비퀴틴화에 관여하는 다양한 단백질을 확보하였으며, Barx2 역시 마찬가지로 MYST와 같은 크로마틴 조절 인자와 PML, Co-REST 등 세포의 분화 및 암 발달과 관련이 있다고 알려진 다양한 후보 단백질군을 얻었다.
YB1은 전사에서 mRNA splicing에 이르기까지 다양한 세포내 현상을 조절하는 인자로, 본 연구개발과제에서는 Msx1과 YB1의 상호작용이 기존에 보고된 것과는 달리 YB1의 분해 산물인 YB1/p32에 특이적이라는 사실을 밝혔으며, 특히 YB1/p32가 독자적으로 세포의 분화를 억제하는 활성을 가지고 있다는 사실을 최초로 규명하였다. 아울러 면역침강법, 형광염색 등 분자, 세포 생물학적 방법을 이용하여 YB1/p32와 Msx1이 협조하여 세포의 분화를 억제하며, 이는 두 단백질의 직접적인 상호작용을 통해 분화 유도인자의 발현을 억제함으로써 이루어진다는 사실을 밝혔다. 그러나, 다양한 난소함 조직에서 비정상적인 YB1의 발현을 확인하였지만, YB1의 발현 억제가 실질적으로 암세포의 생장에 미치는 영향은 낮아 치료를 위한 표적으로는 부적당하고 대신 진단을 위한 표지 유전자로 이용될 가능성을 확인하였다.
본 연구개발과제를 통해 확보한 PARP1은 YB1의 연구와 비슷한 접근방법을 통해 Msx1 세포내 상호작용인자라는 것을 확인하였으며, 특히 small scale tissue microarray를 이용한 면역세포염색방법을 이용하여 제한된 그룹의 난소암에서만 이상발현을 보고한 기존의 연구결과와는 달리 다양한 그룹의 난소암에서 정상 난소조직과는 다른 발현 양상을 보임을 확인하였다. 이러한 결과는, 비록 치료표적으로의 가능성을 배제한다고 할지라도 PARP1 또는 PARP1에 의해 조절되는 유전자군이 난소암 진단에 있어 새로운 표적으로 이용될 수 있을 가능성을 제시하였다. 또한 유비퀴틴화에 의한 단백질 분해과정의 조절에 있어 SUMO화 효소의 하나인 PIAS1이 관여한다는 사실을 밝혀, SUMO화와 유비퀴틴화의 경쟁에 의한 단백질의 분해 조절의 새로운 분자 수준에서의 기전을 제시하였다.
마지막으로 Msx1과 Barx2유전자의 Floxed allele을 가진 표적벡터를 제작하여, 이들 유전자의 조건부 형질결손 마우스를 제작하고자 하였다. 비록 연구기간 내에 형질결손 마우스의 제작 및 이를 이용한 난소암 동물모델의 확립하고자 한 목표에는 미치지 못하였으나, 차후에 개발될 암발생의 마우스모델은 이를 이용한 초기암의 발달 과정 규명 및 초기 난소암의 진단에 기여할 수 있을 것으로 기대하고 있으며, 계속적인 연구를 통해 난소암 동물모델을 확립할 계획이다.