I. 제목
줄기세포의 분화 관련 후성유전체 연구
II. 연구개발의 목적 및 필요성
1. 목적
차세대염기서열결정기술을 이용하여 미분화 및 분화 단계의 줄기세포에 대한 whole-genome DNA 메칠 코드, 히스톤 코드, 뉴클레오솜 지도 등, 후성유전체의 주요 요소에 대한 정보를 대량으로 생산하여 줄기세포의 후성유전체 지도 작성에 필수적인 정보를 제공함과 동시에, 주요 요소들의 종합적인 네트워크를 규명하여 줄기 세포의 분화 관련 유전체 조절기전을 밝히고자 함
2. 필요성
줄기세포의 안정성은 후성유전학적으로 DNA 메틸화 및 히스톤 단백질 수식에 따라 크로마틴 구조 리모델링에 의해 일정하게 유지되고 있음. 그러나 배양 환경에 따라 DNA 메틸 양상 및 히스톤 수식의 변화로 인해 유전자의 이상 발현이 초래되어 안정성이 깨질 수 있으므로 각 줄기세포주에 대한 후성유전체학적 특성에 관한 정보가 매우 중요함. 방대한 량의 염기배열을 해독하는데 필요한 비용과 시간을 획기적으로 줄인 차세대 게놈시퀀서들이 등장하였으며, 크로마틴 면역 침강법 (ChIP)과 메틸 DNA 침강법 (MBD)이 차세대 게놈 시퀀싱과 접목되면서 보다 정밀한 Genome wide 후성유전학분석이 가능해짐. 줄기 세포의 후성유전체 특성을 규명하고 미분화/분화 특이적인 후성유전적 표지자를 대량으로 발굴하기 위해서는 ChIP-Seq 또는 MBD-Seq 기술을 활용한 통합적 후성유전체 분석기술의 조기 확립이 필요하며, 이를 적극 활용하여 줄기 세포의 후성유전체 특성 규명을 통한 분화 관련 후성인자의 대량 발굴은 줄기 세포의 분화유도기술 개발을 촉진하여 이로 인한 산업적 활용기술 개발에 활력을 불어 넣을 것으로 기대됨.
III. 연구개발의 내용 및 범위
1. 인간배아줄기세포를 대상으로, 유전자 발현에 중요한 히스톤 H3의 K4,K9, K27의 메틸화 및 히스톤 H2B의 K120 유비퀴틴화를 ChIP-Seq 방법으로 분석함. 인간배아줄기세포 DNA를 대상으로 메틸-CpG 분포를 MBD-Seq 방법으로 분석함
2. 분화단계별/계통별 특이적 후성유전학적 후보 표지자를 동정하여 메틸 정량화 및 유전자 발현 정보와의 연관분석을 통해 후성유전학적 표지자를 확정함. 인간배아줄기세포로부터 내배엽 (definitive endoderm) 및 간세포(hepatocyte)로 분화단계를 판별할 수 있는 DNA메틸화 바이오마커를 개발함. 또한, 인간배아줄기세포가 신경전구체세포 및 도파민뉴런으로 분화될 때 일어나는 lineage specific DNA 메틸화 변화를 연구함
3. 줄기세포의 유지에 중요한 단백질들을 발현하고 이를 동정하여 이들의 분자 기전을 규명함. 줄기세포 유지에 중요한 유전자들의 후성유전학에 관련된 단백질체에 의한 후기 단백질 변형 (PTM. post-translational modification) 기전을 연구함. 앞서 얻어진 기초적인 자료를 이용하여 줄기세포 유지에 중요한 단백질의 PTM의 변형에 의한 줄기세포 유지 기전을 규명함.
4. 줄기세포를 포함한 생명체의 후성유전체를 효과적으로 연구하기 위한 다양한 종류의 생물정보학적 도구들을 개발하고 관련 데이터베이스들을 구축/통합하고 이들을 적절히 연결하는 후성유전체 연구를 위한 생물정보학 파이프라인을 개발함. 이를 위해 후성유전체 데이터 통합과 줄기세포 특이적 후성유전체 정보 발굴 및 후성유전 인자 사이의 상호 작용 규명함.
IV. 연구개발결과
1. MBD-seq, ChIP-Seq 기술 확립
체계화된 MBD 기술을 차세대 시퀀싱으로 분석함으로써 보다 정밀한 whole-genome DNA methylation profile을 분석하기위한 기술을 확립함
유전자 침묵의 기전으로 알려진 히스톤 H3의 Lys 9과 Lys 27의 메틸화 및 유전자 발현의 촉진 기전으로 알려진 히스톤 H3의 Lys 4과 Lys 36의 메틸화 등 정밀한 whole-genome 히스톤 mapping을 분석하기위한 기술을 확립함
2. 인간배아줄기세포를 내배엽 및 간세포로 분화시킨 세포의 transcriptome과 DNA methylome 분석
인간 배아줄기세포(CHA-hES4)를 내배엽 전구체 및 간세포로 분화시킨 세포를 대상으로 Expression bead array를 이용한 Transcriptome 분석과 MBD-seq 기술을 이용한 Methylome 분석을 수행함. 분화 단계를 규명할 수 있는 DNA메틸 바이오마커 발굴
3. 인간배아줄기세포를 신경전구체세포 및 도파민뉴런으로 분화시킨 세포의 transcriptome, DNA methylome, DNA hydroxymethylome 분석
인간 배아줄기 세포(H9)를 신경전구체세포 및 도파민뉴런으로 분화시킨 세포를 대상으로 Expression bead array를 이용한 Transcriptome 분석과 MBD-seq 기술을 이용한 Methylome 분석, hmeDIP-seq 기술을 이용한 DNA hydroxymethylome 분석을 수행함. 인간배아줄기세포가 특정 lineage로 분화될 때 일어나는 DNA 메틸화, 하이드록시메틸화 패턴의 변화를 연구함
4. 줄기세포 관련 후성유전체 DB구축 및 유전자 발현과 히스톤 변형 사이의 상관 관계를 파악할 수 있는 웹서버 개발 함. 나아가 히스톤 H2B 유비퀴틴화의 새로운 기능을 규명하여 줄기세포 유지/분화 조절 프로토콜 정립에 필요한 가설 생성 함. 마지막으로 히스톤 단일 염기의 유전자 조절 기능을 파악하여 다양한 가설을 제시함
V. 연구개발결과의 활용계획
인간배아줄기세포의 분화에 따른 후성유전체의 변화를 규명하기 위한 whole-genome 분석법은 최신의 기술로서 광범위한 후성유전체 연구에 활용할 수 있음
또한 후성유전학적 표준 마커의 탐색 및 개발에 속도가 증가하게 됨으로써 줄기세포의 안전성 확보 기술과 같은 미래 줄기세포치료 시장을 선점 할 수 있는 핵심 기술을 개발 하는데 큰 역할을 할 것임
더욱이 본 연구과제에서 얻어진 후성유전체적 특성에 대한 정보는 3세부와 연계하여 데이터베이스를 구축하고 서비스를 하여 다른 연구자들에게 공개됨으로서 관련 학문연구에 귀중한 기초자료로 활용하게 됨과 동시에 더 나아가 줄기세포의 관리 및 추적 기술 개발 도움이 될 것임