Ⅰ. 제목
비천연아미노산돌연변이를 통한 변형 ARS의 고속합성시스템 개발
Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성
비단백질성 아미노산, 특히 번역 후 수식을 포함하는 아미노산을 위치 선택적으로 목적 단백질에 도입하는 기술은 해당 단백질의 기능 및 구조를 분석하는데 매우 중요한 역할을 담당하게 될 것이다. 본 연구는 암 치료에 관련된 여러 가지 ARS를 목적단백질로 하여 특정 번역 후 수식 (아세틸화, 인산화 등)이 어떤 역할을 하는 지 밝히기 위해 해당 번역 후 수식을 포함하는 단백질을 쉽고 빠르게 합성하는 플랫폼 기술을 개발하는 것을 목표로 한다.
Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
비단백질성 아미노산을 단백질에 위치 선택적으로 도입하기 위해서는 생명체가 사용하는 20 가지의 아미노산에 의한 tRNA의 아미노아실화, 그리고 코돈 암호 시스템을 회피하여야 한다. 이를 위해서는 다음과 같은 세 가지 조건이 만족되어야 한다. 즉, 1) 코돈 암호 시스템을 회피할 수 있어야 하고, 2) 비단백질성 아미노산과 tRNA의 결합을 선택적으로 만들 수 있어야 하며, 3) 단백질 합성을 유연하게 수행할 수 있는 적절한 합성 시스템이 개발 되어야 한다. 이들 조건을 만족하면서 신약 개발 및 연구에 필요한 비단백질성 아미노산이 도입된 단백질 합성 플랫폼의 개발을 목표로 하였다.
Ⅳ. 연구개발결과
코돈 암호 시스템을 회피하기위해 생명체가 아미노산의 암호화에 사용하지 않는 번역 중단 코돈을 사용하거나 혹은 단백질 발현 숙주로 사용할 생명체가 낮은 빈도로 사용하는 코돈(CCC)을 적절히 변형한 4-뉴클레오티드 코돈(CCCG)을 사용하였다. 비단백질성 아미노산을 도입하는 데 있어 가장 핵심적인 기술은 tRNA를 비단백질성 아미노산으로 아미노아실화 하는 것인데 본 연구에서는 변이 ARS를 사용하는 방법, 아미노아실화 리보자임 (플렉시자임)을 사용하여 그 효율을 비교한 바, 리보자임을 이용하는 것이 더 보편성을 지니는 것을 알 수 있었다. 단백질 합성 시스템으로는 발현의 유연성, 발현 조건의 변화 및 조절 가능성을 고려하여 대장균 유래의 무세포 단백질 합성 시스템을 사용하였다. 무세포 단백질 생산 시스템은 대장균 파쇄액을 그대로 사용하는 S12 시스템과 단백질 합성에 필요한 모든 인자를 분리한 후 재조합하여 사용하는 PURE 시스템 등이 있는데, 이들을 비교한 바 S12 시스템을 사용하는 것이 더 보편성을 지니며 단백질 합성량 등에서 우위를 점하는 것으로 나타났다. 이들 조건을 모두 결합하여 신약 개발 및 연구에 필요한 비단백질성 아미노산이 도입된 단백질 합성 플랫폼을 개발하고, 프로토콜화 하였다.
Ⅴ. 연구개발결과의 활용계획
비단백질성 아미노산이 도입된 단백질 합성 플랫폼은 아세틸화나 인산화 등 번역 후 수식이 포함된 단백질의 생화학적 연구에 사용될 수 있으며, 이들 단백질은 구조 연구, 혹은 신약 개발의 목적 단백질로 활용될 수 있다. 특히 번역 후 수식이 중요한 단백질의 경우 해당 수식이 없는 단백질을 사용한 약품 개발이 갖는 한계를 고려할 때 이 플랫폼은 매우 유용하게 사용될 것이다. 또한 비단백질성 아미노산은 번역 후 수식을 포함하는 아미노산에 국한되지 않으므로, X-선 회절을 이용한 구조 분석이나 NMR을 이용한 구조 분석에 필요한 probe 역할을 하는 아미노산을 목적 단백질의 특정 위치에 삽입하여 구조 분석을 획기적으로 간편화할 수 있는 가능성이 높다.