Ⅰ. 제목
LRS와 상호작용체에 대한 구조적 분석
Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성
Aminoacyl tRNA synthetases는 단백질을 구성하는 20가지 아미노산과 각각에 짝을 이루는 tRNA를 연결해 주는 효소들로 단백질 생합성과정에 필수적인 효소이다. 이 중 leucyl tRNA synthetase(LRS)는 leucine과 해당 tRNA를 결합시키는 기능이외에 세포내 아미노산의 레벨을 감지하는 센서로 작용한다고 알려져 있다. LRS의 leucine 인식신호는 RagD를 통해 mTORC에 연결되어 세포의 성장과 억제를 결정한다. 또한 LRS는 lung cancer cell의 성장과 전이에 직접 관련성이 있다는 연구보고와 같이 세포내 신호전달체계의 이상으로 인한 질환과 밀접한 관련이 있을 것으로 추정된다. 이에 대한 자세한 원자수준에서의 LRS의 leucine 인식과 신호전달 메카니즘의 이해를 위해서는 LRS 및 이와 결합하는 leucine과의 복합체와 RagD와의 복합체의 입체구조를 규명과 해석이 꼭 필요로 하다.
Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
LRS의 leucine 센서로의 작동기작에 대한 원자수준에서의 메카니즘을 규명하기 위해서는 LRS의 leucine 인식기작과 RagD의 GTPase 활성화 기작에 대한 연구가 필요하며 여기에는 LRS의 결정구조 규명 및 LRS와 leucine의 복합체의 입체구조 그리고 LRS와 RagD의 복합체의 입체구조의 규명이 포함된다. 따라서 본 연구에서는 (1) LRS을 발현, 정제하여 결정체를 제작하고 x-선 회절데이터를 수집하여 결정구조를 규명하는 것과 (2) leucine 의 결합에 따른 LRS 구조적 변화를 조사하기 위해 LRS-leucine 복합체의 생산과 결정체 스크리닝 그리고 (3) LRS와 RagD의 결합복합체를 생산하고 복합체의 결정화조건의 검색을 실시하였다. 또한 (4) aminoacyl tRNA synthetases의 특별한 기능에 대한 이해 향상을 위해 단백질 생합성 초기과정에 관여하는 methionyl tRNA synthetase (MRS)와 결합 파트너인 AIMP3와의 결합체에 대한 연구도 추가하였다.
Ⅳ. 연구개발결과
(1) LRS와 editing 도메인이 제거된 LRS (LRSdED)를 제작하고 대장균에서 다량 발현시키고 순수 정제하였으며 이를 대상으로 결정체 스크리닝을 실시하였다.
(2) LRSdED의 결정체를 제작하였으며 이를 이용하여 X-선 회절데이터를 수집하였다.
(3) LRS의 N-말단 도메인, editing 도메인, helical 도메인 (anticodon binding 도메인), C-말단 도메인으로 나누고 각 도메인과 연결체에 대한 클로닝과 발현 및 정제를 실시하였다.
(4) LRS-RagD 복합체와 LRS-RagB-RagD 복합체의 발현시스템을 개발하고 발현 및 정제를 실시하였다.
(5) RagB와 RagD를 대장균에서 발현, 정제하였으며 이들의 복합체를 생산하였다.
(6) MRS의 다양한 발현 벡터에 클로닝하고 발현 및 정제를 실시하였다.
(7) MRS의 N-말단과 AIMP3의 복합체를 발현 정제하였으며 결정체 스크리닝을 실시하였다.
Ⅴ. 연구개발결과의 활용계획
연구결과로 순수 정제된 LRS와 돌연변이체 그리고 도메인 수준의 단백질은 LRS의 입체구조를 규명하기 위한 단백질결정체의 제작에 사용될 것일 뿐만 아니라 LRS와 결합하는 leucine과 RagD와의 각각의 결합 특성을 밝히는 데로 활용될 것이다. 이는 안정적인 복합체의 제작과 이를 이용한 향후 연구방향인 원자수준의 상세한 LRS 단백질의 구조와 작동기작의 이해 및 RagD를 통해 전달되는 초기단계의 신호전달체계에 대한 확실한 정보를 제공할 것이다. RagB-RagD 복합체, MRS와 MRS-AIMP3 복합체의 생산기법은 이들의 신호전달체간의 상호작용에 대한 고해상도 복합체입체구조의 규명에 활용될 것이며 이는 관련 신호전달시스템에 대한 원자수준에서의 명확한 이해를 도울 것이다. 이는 신호전달체계를 조절할 수 있는 단서를 제공하고 암을 비롯한 다양한 질환치료를 위한 약물개발을 위한 분자구조 정보를 제공할 것이다. 또한 연구 개발된 단백질 생산과 복합체 제조기법은 다른 aminoacyl tRNA synthetase와 이들의 복합체에 대한 연구에 적용할 것이다.