표제지
목차
Ⅰ. 연구개발결과 요약문 5
최종결과보고서 요약문 5
Summary 6
Ⅱ. 학술연구용역과제 연구결과 7
제1장 최종 연구개발 목표 7
1.1. 목표 7
1.2. 목표달성도 및 관련분야에 대한 기여도 9
제2장 국내외 기술개발 현황 10
2.1. 간흡충 연구 동향 10
2.2. 타이간흡충의 담관암 관련 연구 동향 11
2.3. 간흡충 분비배설물이 처리된 숙주세포에서 병리기전 연구 동향 11
2.4. 간흡충이 감염된 숙주세포 및 조직에서 활성산소종 생성 연구 동향 11
2.5. 연구 책임자의 간흡충-숙주세포 병리기전 연구 성과 12
2.6. 암 발병과 metalloproteinases (MMPs) 연구 동향 13
2.7. 세포외 기질에 대한 연구 동향 14
2.8. 담관암 세포주 동향 15
2.9. 참여연구원의 3차원 세포 공동배양 미세유체시스템 기술 성과 15
2.10. 간흡충 관련한 미세유체기반 소자의 연구는 아직 진행된 바 없어, 새롭게 분야를 혁신할 수 있음 16
2.11. 정상 담관 상피세포주 (H69)과 간흡충의 상호작용에 대한 연구는 아직 진행된 바 없음 17
2.12. 3차원 미세환경 내에서 중간엽 줄기세포를 간세포로 분화시키기 위한 연구는 아직 진행된 바 없음 18
제3장 최종 연구개발 내용 및 방법 19
3.1. 연구내용 19
3.2. 연구방법 20
제4장 최종 연구개발 결과 24
4.1. 정상담관세포 및 형광 단클론 담관세포주 확보 25
4.2. 세포외기질에 따른 정상 담관세포의 focal adhesion molecule의 변화 분석 26
4.3. 정상 담관세포 및 담관암 세포의 기질 특이성 29
4.4. 3차원 세포배양모델을 이용한 담관 미세환경 구축 33
4.5. 담관/담관암 미세환경에서의 간흡충 감염 모사 36
4.6. 간/담관 미세환경 조성을 위한 간유래 세포의 3차원 배양 39
제5장 연구결과 고찰 및 결론 45
제6장 연구성과 및 활용계획 48
6.1. 활용성과 48
6.2. 활용계획 49
제7장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 50
제8장 기타 중요변경사항 50
제9장 연구비 사용 내역 및 연구원 분담표 50
9.1. 연구비 사용 내역 50
9.2. 연구분담표 51
제10장 참고문헌 51
제11장 첨부서류 56
표 1. 정상 담관 세포의 growth medium 조성 25
표 2. qPCR을 위한 MMP-1, -8, -13 forward와 reverse primer 31
표 3. 다양한 배양액 조건에 따른 정상 담관 세포 배양 35
표 4/표 2. 중간엽 줄기세포의 간 분화유도 배지 조성 40
표 5/표 3. 분화된 세포를 성숙시키는 배지 조성 40
그림 1. 간흡충 감염 시 일어나는 염증반응 관련 신호전달 체계 7
그림 2. 간흡충 감염에 의한 담관암 유발 기전 8
그림 3. 확립된 미세유체기술 기반 3차원 담관암 세포배양 모델 8
그림 4. 담관암 세포의 2차원/3차원 배양조건 내 간흡충 분비배설물의 영향 9
그림 5. Free radical-mediated inflammation signal pathway in ESP-treated cholangiocarcinoma cells 13
그림 6. 3차원 미세유체시스템의 개념도 16
그림 7. 정석교수팀이 보유중인 3차원 세포 공동배양 미세유체 시스템 기술 예 16
그림 8. 체내 혈관 환경 모사를 위한 micro-fluidic device 와 flow generating pump 17
그림 9. 소자에서의 iRBC 관찰 17
그림 10. Velocity, Pressure, sear-strees 의 관계 17
그림 11. Cryptosporidium parvum에 의한 정상 담관 상피세포(H69)의 TNF-α 발현 분석 18
그림 12. Cryptosporidium parvum에 의한 정상 담관 상피세포(H69)의 TLRs 발현 분석 18
그림 13. 인간 중간엽 줄기세포를 이용한 간분화 연구 19
그림 14. RT² profiler PCR array 21
그림 15. 미세유차소자의 제작 방법 및 ECM 고정 및 세포 배양 23
그림 16. 정상 담관 세포 / 담관암 세포의 3차원 공동배양 모델 및 다양한 형태의 간흡충 분비배설물 처리 24
그림 17. 확립된 배양조건에서 하에서 H69 세포 (scale bar = 200μm) 25
그림 18. GFP(좌)와 RFP (우)를 발현시키는 plasmid 26
그림 19. 확보된 GFP 발현 HuCCT1 clone (위)과 RFP JCK-1 clone (아래) 26
그림 20. Collagen matrix에서 분비배설물 처리에 따른 HuCCT1과 H69세포의 focal adhesion molecule 단백질 발현 양상. Green; paxillin, vinculin, Red; F-actin. (scale bar = 50μm). 27
그림 21. Matrigel matrix에서 분비배설물 처리에 따른 HuCCT1과 H69 세포의 focal adhesion molecule 단백질 발현 양상. Green; paxillin, vinculin, Red; F-actin. (scale bar = 50μm). 27
그림 22. Fibronectin matrix에서 분비배설물 처리에 따른 HuCCT1과 H69세포의 focal adhesion molecule 단백질 발현 양상. Green; paxillin, vinculin, Red; F-actin. (Scale bar = 50μm). 28
그림 23. Collagen, matrigel 및 fibronectin matrix하에서 분비배설물이 처리된 HuCCT1과 H69세포에서 인산화된 paxillin의 발현 양상. Green; 인산화 paxillin, Red; F-actin. (scale bar = 50μm). 29
그림 24. 분비배설물이 처리된 HuCCT1, H69 세포와 처리되지 않은 대조군에서의 ECM & adhesion molecules의 qPCR 반응 양상. 30
그림 25. HuCCT1, H69 세포에서 분비배설물에 의하여 2배 이상 발현 차이를 보이는 유전자군 동정. 30
그림 26. Collagen 환경 하에서 분비배설물이 처리된 HuCCT1, H69 세포에서 MMP-1, -8, -13 mRNA 발현 변화. 31
그림 27. 분비배설물이 처리된 HuCCT1, H69 세포에서 MMP-1, -13 단백질 발현 변화. 32
그림 28. 분비배설물에 의하여 활성화된 NF-κB에 의한 MMP-2, -9 전사조절 32
그림 29. 미세유체 소자 내에서의 정상 담관 세포 배양 모델 및 배양시 정상 담관세포의 생장 특성 33
그림 30. collagen hydrogel의 물리적 특성에 따른 정상 담관 세포의 protrusion 변화 34
그림 31. type I collagen + laminin gel 에서의 정상 담관세포의 protrusion 34
그림 32. 3종류의 배양액 조건에 따른 정상 담관 세포의 protrusion 및 tissue growth 비교 35
그림 33. primary mouse hepatocyte의 3차원 배양 36
그림 34. 간암세포(HepG2)의 3차원 배양 36
그림 35. 간흡충 분비배설물의 다양한 처리 조건 및 정상 담관 세포의 tissue growth와 protrusion 37
그림 36. 간흡충 분비배설물 처리 조건에 따른 정상 담관세포의 tissue growth 및 protrusion 37
그림 37. RPMI-1640 및 H69 serum-free (-)EGF medium에서 담관암 세포의 tissueg rowth와 invasion 38
그림 38. 미세유체 소자 내 정상 담관 세포/담관암 세포 공동 배양모델 38
그림 39. 공동 배양 모델에서 간흡충 분비배설물 처리 조건에 따른 담관암 세포의 침습 현상 39
그림 40. 분화 배지에서의 중간엽 줄기세포 40
그림 41. 고효율의 spheroid 소자 및 protocol 41
그림 42. spheroid 소자 내에서 형성된 조직의 크기 변화 41
그림 43. mouse primary hepatocyte를 이용한 3차원 간조직 형성 42
그림 44. 정상 담관 세포를 이용한 3차원 담관조직 형성 42
그림 45. 간암 세포를 이용한 3차원 담관조직 형성 및 암조직 necrotic core의 모사 43
그림 46. spheroid 소자 내에서의 담관암 세포의 배양 결과 43
그림 47. 간흡충 분비 배설물 처리에 의한 3처원 정상 담관 세포 조직의 크기 증가 44
그림 48/그림 45. 2012년, 2013년 용역연구를 통해 분석한 간흡충 분비배설물과 담관암과의 상호 관계 46
그림 49/그림 46. 간흡충과 담관암 기전 연구를 위한 간유래 조직의 구성 47