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SUMMARY
Contents
목차
제1장 연구개발과제의 개요 24
제1절 연구개발의 필요성 26
제2절 연구개발의 목표 27
제3절 연구개발의 기대효과 27
제2장 국내외 기술개발 현황 30
제1절 국내·외 환경 변화 32
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 34
제1절 방사선 유도 산화스트레스 단백질변형 연구 36
1. 방사선에 의한 산화스트레스 유도 변역 후 변형(PTM) 단백질 연구 36
2. 방사선 유도 PTM 단백질 활성 및 구조 연구 46
3. 방사선 유도 산화스트레스 단백질 영상화/검출 기술 개발 53
제2절 방사선 반응 DNA 손상 및 회복 조절기작 연구 59
1. 방사선 반응 유전자 분자기능 규명 59
2. 환경방사선의 생물학적 안정성 평가 및 감시기술 개발 72
3. 방사선 반응 피지옴 활용 환경정화 및 감시용 생물지원 탐색 75
제3절 방사선 유도 식물 생리활성 대사체 합성 기작 및 이용 연구 78
1. RI이용 식물 이소프렌 생합성 경로 규명 연구 78
2. 방사선 유도 식물 생리활성물질의 주요 병해충 제어에 관한 활용 연구 93
제4절 방사선 반응 식물 유용물질 발굴 및 방사선 분자변환을 통한 고도화 연구 101
1. 방사선 분자 변환기술 기반 확립 101
2. 센티페드그라스 추출물의 기능성 검증 및 증대 연구 109
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 124
제1절 목표 달성도 126
제2절 주요 연구성과 및 파급효과 128
제5장 연구개발결과의 활용계획 132
제1절 연구결과의 활용 방안 134
제6장 참고문헌 136
서지정보양식(BIBLIOGRAPHIC INFORMATION SHEET) 142
표 1. 애기장대에서 일반상태에서 S-sulfhydration된 단백질 목록 39
표 2. 애기장대에서 200 Gy 감마선 조사에 의해 S-sulfhydration된 단백질 목록 42
표 3. BRH2 변이균주 제조 및 qRT-PCR 분석을 위해 사용된 프라이머 62
표 4. AGO2 유전자와 발현 패턴이 유사한 전사조절인자 목록 67
표 5. 감마선 조사 후 애기장대와 벼의 주요 DDR 유전자 발현 비교. 발현 수준은 대조구와 감마선... 73
표 6. 벼 DDR 유전자의 qRT-PCR에 사용된 primer 서열. 괄호는 각 유전자의 Rice Annotation... 74
표 7. Na 또는 Cs 흡수 관련 유전자 및 qRT-PCR을 위한 primers 77
표 8. 벼 식물체에 존재하는 Aldehyde dehydrogenase(ALDH) superfamily 80
표 9. 기질에 따른 OsALDH2-1 단백질의 enzyme kinetics 분석 결과 84
표 10. Mass spectrum 결과로부터 각 식물스테롤의 isotopologue를 추출. (a) Campesterol의... 89
표 11. 식물스테롤의 isotopologue 패턴 분석. (a) Campesterol의 isotopologue 조성비율 결과.... 91
표 12. 단일 분리된 CG12의 NMR 분석 결과 111
그림 1-1. modified Biotin-switch assay 모식도. NaHS, SH 공여체; MMTS, 환원된 Cys 잔기의 알킬화 시약 37
그림 1-2. 웨스턴 분석을 통한 S-sulfhydration 단백질 검출 37
그림 1-3. iodoTMTsixplex 시약과 표지 반응 38
그림 1-4. AtTDX 단백질의 구조 확인 47
그림 1-5. AtTDX 단백질의 (a) Insulin reductase 및 (b) Holdase 활성 분석 47
그림 1-6. S-sulfhydration 검증을 위한 AtTDX 단백질의 modified biotin-switch assay 48
그림 1-7. S-sulfhydration에 의한 AtTDX 단백질의 구조 및 활성 변화. (a) 구조 변화 관찰,... 49
그림 1-8. AtTDX 단백질의 S-sulfhydration된 Cys 위치 분석을 위한 Cys mutant 단백질 제작.... 50
그림 1-9. AtTDX 단백질의 wild type 및 Cys mutant 단백질의 Insulin reductase (a) 및... 51
그림 1-10. S-sulfhydration Cys 잔기 확인을 위한 AtTDX와 mutant 단백질의 modified... 51
그림 1-11. S-sulfhydration 확인을 위한 AtAPX1 단백질의 modified biotin-switch assay 52
그림 1-12. S-sulfhydration에 의한 AtAPX1 단백질의 구조 분석. a) size exclusion... 52
그림 1-13. AtAPX1의 구조 및 기능에 대한 S-sulfhydration의 영향. a) NaHS로 처리된 AtAPX1의... 53
그림 1-14. 영상화 프로브를 활용한 산화스트레스의 영상화 개념도 55
그림 1-15. ONOO-와 반응 프로브의 디자인 55
그림 1-16. ONOO-와 반응한 프로브의 활성화의 제안된 메카니즘 55
그림 1-17. 시약 및 조건: (a) EtOAc, butylamine, RT, 12h; (b) EtOAc, Piperidine, 80 ℃,... 56
그림 1-18. ONOO- 진단제의 다양한 ROSN과 반응성 HPLC 분석 결과 57
그림 1-19. RAW 264.7 세포를 활용한 세포내 ONOO- 진단제의 활성화 영상화 58
그림 2-1. 식물, 동물 및 미생물의 Brh2 유사 단백질의 domain 분석. 웹기반의 Pfam 분석 시스템을... 60
그림 2-2. 방사선 조사 및 유전독성 물질 처리 시 BRH2 유전자의 발현 변화. 유전자 특이적 프라이머를... 60
그림 2-3. DDR 조절인자 변이균에서의 BRH2 유전자의 발현 변화.... 61
그림 2-4. BRH2 변이균주 제조를 위한 프라이머 디자인... 62
그림 2-5. BRH2 변이균주를 이용한 감마선 및 유전독성 저항성 테스트 63
그림 2-6. 감마선 처리 조건에서의 Bdr1 전사조절인자 비의존적 BRH2의 발현 변화 64
그림 2-7. brh2 bdr1 이중 변이균주 제조를 통한 Brh2의 유전 독성 스트레스 기능 규명 64
그림 2-8. AGO2 promoter의 cis -element와 핵단백질 간의 결합 패턴 분석. (a) AGO2... 65
그림 2-9. AGO2 promoter의 cis -element와 핵단백질 간의 결합 패턴 분석. (a) Zeocin이 처리된... 66
그림 2-10. DSB 처리 후 전사조절인자들의 발현 패턴 분석 67
그림 2-11. 전사조절인자 돌연변이체의 AGO2 유전자 발현 패턴 분석.ACT2는 endogenous control로 이용 68
그림 2-12. ANAC78 전사조절인자와 AGO2 cis -element와의 결합 능력 분석. (a) ANAC78 재조합... 69
그림 2-13. 식물체 내에서의 ANAC78 전사조절인자와 AGO2 promoter의... 70
그림 2-14. cis -element(CCACACC)의 single mutation 후의 결합 능력 분석. (a) 23종의... 71
그림 2-15. 전사 조절을 통한 감마선 반응 생물학적 경로 규명. 대조구와 감마선 조사구에서 각 유전자의... 72
그림 2-16. 감마선 반응 전사체의 주요 GO terms과 계층구조. 웹기반의 GO 분석 도구인 "agriGo... 73
그림 2-17. 주요 DDR 유전자의 감마선 선량평가 모델. OsUBi가 대조구 유전자로 사용됨 74
그림 2-18. CsCl와 NaCl 또는 mannitol의 병용 처리 후 애기장대 식물체의 표현형 비교 76
그림 2-19. CsCl와 NaCl 또는 mannitol의 병용 처리 후 Na 흡수유전자 발현 비교 77
그림 3-1. 현재까지 알려진 식물체에서의 이소프렌 생합성 경로 및 알코올 발효 경로 78
그림 3-2. OsALDH2-1 유전자의 재조합 단백질 발현. (a) 단백질 과발현 벡터 pGEX-4T-3(GST)에서의... 81
그림 3-3. OsALDH2-1 단백질(crude protein)의 ALDH 효소 활성 분석. (a) 최적 조건의 단백질... 82
그림 3-4. OsALDH2-1 단백질의 순수 정제. (a) TALON metal affinity chromatography resin을... 83
그림 3-5. OsALDH2-1 단백질의 ALDH 효소 활성 분석을 위한 최적 조건 탐색. (a) OsALDH2-1... 83
그림 3-6. 기질에 따른 OsALDH2-1 단백질의 효소 활성 분석. (a) 기질 농도에 따른 속도 변화량... 84
그림 3-7. ALDH 유전자의 돌연변이체 선별. (a) 돌연변이체의 T-DNA 삽입 위치. (b) Genomic... 85
그림 3-8. aldh2-1 돌연변이체의 가뭄 스트레스 저항성.2달간 생장한 식물체는 7일간 가뭄 처리(drought)... 86
그림 3-9. GC-MS 기법을 이용한 식물스테롤 분석. (a) 식물스테롤의 chromatogram 분석. (b) 식물스테롤의... 87
그림 3-10. 식물스테롤의 mass spectrum 분석. (a) Campesterol의 mass spectrum 분석. (b)... 88
그림 3-11. IsoCor 분석 프로그램. (a) IsoCor의 실제 작동 화면.... 90
그림 3-12. 식물스테롤의 isotopologue 조성비율 분석. (a) Campesterol.... 92
그림 3-13. 벼 식물체의 [C-13]-ethanol 처리 후 식물스테롤의... 93
그림 3-14. Thymol에 의한 세포 내 calcium transporter/channel 유전자 발현 변화... 94
그림 3-15. Calcineurin 변이 균주에서의 thymol 처리 후 세포 내... 95
그림 3-16. Calcineurin 변이 균주에서의 thymol 처리 후... 95
그림 3-17. Thymol 처리 후 Crz1 전사인자의 인산화 변화 및... 96
그림 3-18. Thymol 처리 후 CPY 단백질의 당화 변화 97
그림 3-19. Thymol 처리 후 산화적 스트레스 관련 유전자의 발현 변화... 97
그림 3-20. Thymol 처리 후 ergosterol 합성 관련 유전자의 발현 감소 98
그림 3-21. 신규 합성한 카본의 구조개선 물질 98
그림 3-22. 카본 유도체 화합물 01의 제조 방법 모식도 99
그림 3-23. 카본 유도체 화합물 02의 제조 방법 모식도 99
그림 3-24. 카본 유도체 화합물 03의 제조 방법 모식도 100
그림 3-25. 카본 유도체 화합물 04의 제조 방법 모식도 100
그림 3-26. 카본 유도체 화합물 05의 제조 방법 모식도 101
그림 3-27. 카본 구조개선 물질의 Xanthomonas 생육 억제 활성 101
그림 4-1. HPLC 및 LC-MS를 이용한 방사선 조사 프레드니솔론의 구조변화 분석 102
그림 4-2. 방사선 조사된 프레드니솔론이 간세포암종(Huh7 및 HepG2) 세포 활성에 미치는 영향.... 103
그림 4-3. 방사선 조사된 프레드니솔론이 Huh7세포 사멸에 미치는 영향.... 104
그림 4-4. 방사선 조사된 프레드니솔론이 DNA fragmentation에 미치는 영향.... 105
그림 4-5. 방사선 조사된 프레드니솔론이 Huh7세포의 세포주기 및 세포 사멸에 미치는 영향.... 106
그림 4-6. 방사선 조사된 프레드니솔론이 Huh7세포에서 내인성 및 외인성 세포사멸경로에 미치는 영향 107
그림 4-7. 방사선 조사된 프레드니솔론이 Huh7세포에서 미토콘드리아 막전위에 미치는 영향 108
그림 4-8. 센티페드그라스로부터 CG12의 순수 분리 과정 109
그림 4-9. 단일 분리된 CG12의 HPLC 및 LC/MS 분석 결과 110
그림 4-10. 단일 분리된 CG12의 H-NMR (좌) 및 C-NMR (우) 분석 결과 111
그림 4-11. NIH-3T3세포에서 CGE가 H₂O₂ 유도 세포손상에 미치는 영향 112
그림 4-12. NIH-3T3세포에서 CGE의 H₂O₂ 매개 ROS 소거능 측정 113
그림 4-13. NIH-3T3세포에서 CGE가 H₂O₂ 유도 세포사멸에 미치는 영향 114
그림 4-14. 방사선이 조사된 NIH-3T3세포에서 CGE가 세포사멸에 미치는 영향 115
그림 4-15. 방사선이 조사된 NIH-3T3세포에서 CGE가 내인성 apoptosis 경로에 미치는 영향 116
그림 4-16. 방사선이 조사된 NIH-3T3세포에서 CGE가 MAPK 조절에 미치는 영향 116
그림 4-17. 방사선이 조사된 B16F-1 및 SKMEL-5세포에서 CGE가 세포생존율에 미치는 영향 117
그림 4-18. 방사선이 조사된 B16F-1 및 SKMEL-5세포에서 CGE가 세포사멸에 미치는 영향 119
그림 4-19. 방사선이 조사된 B16F-1 및 SKMEL-5세포에서 CGE가 세포주기에 미치는 영향 120
그림 4-20. 방사선이 조사된 B16F-1 및 SKMEL-5세포에서 CGE가 세포증식 및 세포주기조절 단백질... 121
그림 4-21. 방사선이 조사된 B16F-1 및 SKMEL-5세포에서 CGE가 MAPK 조절에 미치는 영향 122