[표지] 1
연구진 2
목차 3
요약문 7
Abstract 8
I. 서론 9
1. 신기술 (유전자가위 등)의 개요 및 개발 역사 9
가. 새로운 유전체 개발 기술(유전자가위 등)의 발달 9
나. 신기술의 종류 및 개발 동향 10
2. 국내·외 신기술 유래 유전자변형생물체 연구개발 현황 17
가. 신기술 적용 작물별 LMO 개발 현황 19
나. 신기술 적용 LM 가축 개발 현황 20
다. 신기술 적용 해양수산 분야 LMO 개발 현황 21
3. 신기술 적용 LMO 위해성평가 및 안전관리의 중요성 24
가. 신기술(RNAi, 유전자가위 기술 등) 적용 LMO 안전관리 필요성 24
나. 신기술 적용 LMO 위해성평가 요소 25
4. 국내·외 신기술 적용 LMO에 대한 국가별 안전관리 방안 26
가. 미국의 NBT 규제 면제 제도 26
나. 일본의 NBT 규제 제도 27
다. 아르헨티나의 NBT 규제 제도 29
라. 호주의 NBT 규제 제도 30
마. 유럽연합 NBT 규제 제도 31
바. 캐나다 NBT 규제 제도 31
사. 브라질 NBT 규제 제도 32
아. 스위스 NBT 규제 제도 32
자. 한국 NBT 규제 면제(완화) 제도 32
5. 국내·외 신기술 적용 LMO 판별 기술 종류 32
가. Digenome-Seq 분석법 33
나. Circle-seq 분석법 34
다. GUIDE-seq 분석법 35
라. in-silico 예측 분석법 36
II. 연구내용 및 방법 37
1. 신기술 적용 형질전환 LM 작물 제작 및 목표 유전자 검증 37
가. 신기술 이용 형질전환 LMO 제작 37
나. 형질전환 LMO 작물 검증을 위한 genomic DNA 분리 및 deep-sequencing 분석 39
2. 신기술 적용 LMO 우성형질 선별 및 발현산물 분석 41
가. 신기술(유전자가위) 적용 형질전환 LMO genomic DNA 분리 및 NGS 분석 41
나. 신기술(RNAi) 적용 형질전환 LMO genomic DNA 분리 및 PCR 분석 42
다. 신기술 LM 작물 발현물질(단백질) 변화 분석 43
3. 신기술 적용 우성형질 LMO 생물학적 특성 분석 45
4. 작물별 신기술(유전자가위) LMO 판별 방법 개발(계속) 46
가. 유전자가위 기술 적용 LMO genomic DNA 분리 46
나. 신기술 적용 LMO 판별 방법 개발 47
5. LMO 연구실 사전유해인자위험분석 보고서 작성 48
III. 연구 결과 49
1. 신기술(CRISPR-Cas9) 적용 LM 작물 선별을 위한 배양 및 유전자 판별 49
가. 신기술(CRISPR-Cas9) 적용 LM 작물 콩 제작 및 선별 49
나. 신기술(CRISPR-Cas9) 적용 LM 작물 토마토 제작 56
2. 신기술(RNAi, 유전자가위) 적용 우성형질 LM 작물 발현물질 분석 58
3. 신기술 적용 우성형질 LM 작물(담배) 생물학적 특성 분석 61
가. 신기술(RNAi) 적용 LM 작물 표현형 검증 항목 분석 61
나. 신기술(RNAi) 적용 우성형질 LM 작물(담배) 이용 생물학적 특성 분석 65
다. 선별된 신기술 적용 LM 작물 근연종 조사 및 생물학적 특성 비교 분석 74
4. 작물별 신기술(유전자가위) LMO 판별 방법 개발(계속) 75
5. 환경부 연구실 유해인자 표준안 개발(사전유해인자위험분석 보고서 작성 및 검증) 80
IV. 고찰 및 제언 90
참고문헌 93
부록 1 101
1. 연구결과 활용 101
2. 사전유해인자위험분석 보고서 경진대회 우수상 104
표 1. 신기술(유전자가위 등)을 이용한 LM 작물 연구개발 동향 17
표 2. 신기술을 이용한 LM 가축 개발 현황 20
표 3. 신기술을 이용한 LM 어류 개발 현황 22
표 4. 신기술을 이용한 LM 미세조류 개발 현황 23
표 5. 미국의 규제 면제 개요(SECURE-Rule) 26
표 6. 일본의 NBT 규정 개요 27
표 7. 아르헨티나의 NBT 규제 개요 29
표 8. 호주의 NBT 규제 제도 30
표 9. FAD2 1차 PCR primer 정보 40
표 10. FAD2 2차, 3차 PCR primer 정보 40
표 11. DvSnf7와 GFP 유전자의 발현 여부 확인을 위한 프라이머 정보 42
표 12. DvSnf7와 GFP 유전자의 발현 여부 확인을 위한 PCR 반응 조성 43
표 13. PCR 반응 조건 43
표 14. 유전자가위 기술 적용 콩 유전자 indel primer sequence 47
표 15. 유전자가위 기술 적용 토마토 유전자 indel primer sequence 47
표 16. Indel 유전자 판별을 위한 PCR 조건 48
표 17. 각 샘플의 단백질 및 loading 양 59
표 18. RNAi 적용 LM 작물의 동등성 평가 범위 및 항목 61
표 19. 애기장대 유래 nan-1D 유전자의 담배도입 및 형질전환체 형태분석 63
표 20. DvSnf7와 GFP dsRNA 발현 형질전환체 담배의 표현형 비교 항목 선정 64
표 21. 생물, 비생물, 영양적 특성에 대한 CRISPR 기반 유전자 편집의 적용 79
표 22. 연구개발활동안전분석 보고서(사전유해인자위험분석) 81
그림 1. 생명공학기술로 개발된 유전자변형생물체 9
그림 2. 유전자변형생물체 세계 시장 규모 9
그림 3. 유전자가위 기술을 이용한 유전자변형생물체 개발 10
그림 4. RNAi 기반 유전자 조절 과정 12
그림 5. 표적 핵산분해효소의 작용 및 DNA 결합위치. 13
그림 6. ODM 작용기전 14
그림 7. 시스 제네시스와 인트라 제네시스을 이용한 신기술 14
그림 8. 역육종 작용기전 15
그림 9. 아그로접종 작용기전 16
그림 10. RNA-dependent DNA Methylation(RdDM) 작용기전 17
그림 11. 세계 신기술 적용 LMO 위해성평가 원칙 체계도 25
그림 12. Digenome-Seq 분석법 33
그림 13. Circle-seq 분석법 34
그림 14. GUIDE-seq 분석법 35
그림 15. 형질전환용 종자 소독 및 항생제 처리 37
그림 16. Agrobacteria 접종 및 공동배양 38
그림 17. Wash out 및 SI(Shoot Induction) 배지로 계대배양 38
그림 18. PPT 저항성 확인 및 LP(Large Pot) 이식 순화 39
그림 19. 2-DE 샘플의 Match set 부분 이미지 분석 방법 45
그림 20. 야생형과 CRISPR-Cas9 적용 FAD2(고올레산 생산) 발현 LM 콩의 표현형 비교 50
그림 21. 콩 FAD2 유전자의 결손 여부를 확인하기 위한 1차 PCR 결과 50
그림 22. 콩 FAD2 유전자의 결손 여부를 확인하기 위한 2차 PCR 결과 51
그림 23. FAD2-A sequence analysis data(7bp deletion) 52
그림 24. FAD2-B sequence analysis data(7bp deletion) 52
그림 25. 형질전환 작물 배양 및 종자 확보 53
그림 26. T1 세대 작물에서 FAD2 유전자의 결손 여부를 확인하기 위한 1차 PCR 결과 53
그림 27. T1 세대 작물에서 FAD2 유전자의 결손 여부를 확인하기 위한 2차 PCR 결과 54
그림 28. T1 작물 이용 FAD2-A sequence analysis data(7bp deletion) 54
그림 29. T1 작물 이용 FAD2-B sequence analysis data(7bp deletion) 55
그림 30. T0 작물 배양 및 T1 종자 확보 55
그림 31. GAD3 유전자 clone 돌연변이 확인(2bp deletion) 57
그림 32. T0 종자 확보를 위한 형질전환 토마토 배양 57
그림 33. LM 작물에서 분리한 전체 단백질 변화 분석 58
그림 34. LM 작물에서 분리한 전체 단백질 변화 분석 59
그림 35. 4개 작물체를 이용한 단백질 변화 spot 분석 60
그림 36. 단백질 변화 spot 분석 60
그림 37. RNAi 적용 DvSnf7와 GFP dsRNA 발현 우성형질 LM 담배 선별 과정 66
그림 38. PCR 방법을 이용한 DvSnf7와 GFP dsRNA 발현 검증 67
그림 39. DvSnf7와 GFP dsRNA 발현 검증 및 화분 이식 67
그림 40. 60일 경과 후, 담배 형질전환체 신장, 줄기 및 잎 모양 등 표현형 분석 68
그림 41. 60일 경과 후 담배 형질전환체 식물고(plant height) 69
그림 42. 60일 경과 후 담배 형질전환체 잎의 크기와 모양 비교 69
그림 43. 60일 경과 후, 담배 형질전환체 잎의 DvSnf7와 GFP dsRNA 발현 검증 70
그림 44. 꽃자루(Peduncle)와 꽃잎(Petal) 표현형 분석 결과 71
그림 45. 90일 경과 후, 담배 형질전환체 신장, 줄기 및 잎 모양 등 표현형 분석 72
그림 46. 90일 경과 후, 담배 형질전환체 식물고(plant height) 73
그림 47. 90일 경과 후, 담배 형질전환체 잎의 크기와 모양 비교 73
그림 48. 종자가 맺힌 후, 담배 형질전환체 표현형 분석 74
그림 49. LM 토마토 목표 유전자 판별을 위한 specific primer TM 온도 설정 76
그림 50. LM 토마토를 이용한 목표 유전자 판별 77
그림 51. 우성형질 LM 콩을 이용한 목표 유전자(FAD2-A) 검증 77
그림 52. 우성형질 LM 콩을 이용한 목표 유전자(FAD2-B) 검증 78
그림 53. NGS 분석을 통한 목표 유전자 결손 여부 확인 78