[표지] 1
[요약] 2
2. 제출문 10
보고서 요약서 11
국문 요약문 12
SUMMARY 13
6. 영문목차 14
목차 15
1. 연구개발과제의 개요 17
1-1. 연구개발 목적 17
1-2. 연구개발의 필요성 18
1-3. 연구개발 범위 20
2. 국내외 기술개발 현황 21
3. 연구수행 내용 및 결과 25
(1세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 1: 각막 상피 손상 모델 개발 25
1) 알칼리를 이용한 가토 각막 손상 모델 25
2) LSCD(limbal stem cell deficiency) model 제작 28
(1세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 2: 동물 유래 각막 상피 세포 분리 및 대량 증식법 연구 30
1) 각막 상피세포 배양용 배지의 최적화 30
2) 가토에서 각막 상피세포 분리 35
3) 각막 상피세포 배양 조건의 최적화 36
4) 가토에서 분리 배양한 각막 상피세포의 대량 배양 방법 38
(1세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 3: 각막 상피 세포시트 동물 이식 및 세포 재생 추적 관찰 41
1) 소 양막의 손상된 각막 상피 이식 동물 실험(대조군) 41
2) 각막 상피 세포시트의 손상된 각막 이식 동물 실험 42
3) 양막 및 각막 세포 시트 이식 결과 43
(1세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 4: 인체 유래 각막 상피 세포 분리 및 대량 증식법 연구 51
(1세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 5: 인체 유래 세포시트 기반 각막 재생 동물 실험 및 장기 추적 관찰 52
1) 각막상피 52
2) 각막상피 손상 모델(LSCD)을 이용한 각막상피세포시트 이식(8주 관찰) 54
3) 각막상피 손상 모델(LSCD)을 이용한 각막상피세포시트 이식(4주 관찰) 55
4) 각막상피 손상 모델(LSCD)을 이용한 각막상피세포시트 이식(2주 관찰) 56
5) 각막상피 손상 모델(LSCD)을 이용한 각막상피세포시트 이식(2주 관찰) 57
6) 이식한 시트를 추적할 수 있는 reporter system 59
(1세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 6: 각막 내피 세포 손상 모델 개발 60
1) Rabbit을 이용한 각막내피세포 손상모델 - I 60
2) Rabbit을 이용한 각막내피세포 손상모델 - II 62
(1세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 7 : 동물유래 각막 내피세포 분리 및 대량 증식법 연구 63
(1세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 8: 인체 각막 내피세포 분리 및 대량 증식법 연구 69
1) 인간 각막 내피세포 분리 및 대량 증식법 - I 69
2) 인간 각막 내피세포 분리 및 대량 증식법 - II 71
3) 인간 각막 내피세포 분리 및 대량 증식법 - III 72
4) TGF-b inhibitor를 이용한 인간 각막 내피세포 증식 확인 72
5) 배지의 종류에 따른 인간 각막 내피세포 증식 및 배양 확인 73
6) BMP-7 처리 시 인각 각막 내피세포의 형태 비교 74
(1세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 9: 각막 내피 세포시트 동물 이식 및 세포 재생 추적 관찰 75
1) 콜라겐 필름을 이용한 세포시트 이식 방법 확립 75
2) 미니 시트 및 스페로이드 각막내피세포 이식 실험 76
3) 내피 손상 직후 스페로이드와 미니시트 이식결과 확인 4주 관찰 79
4) 내피 손상 7일 후 손상정도 확인 후 스페로이드 및 미니시트 이식 실험 81
(2세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 1: 효소 감응성 소재 합성 및 평가 85
(2세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 2: 효소 감응성소재의 세포 배양 용기 코팅법 최적화 86
1) 효소감응성 소재의 Trans well 위에 코팅 후 표면 확인 86
2) 효소감응성 소재의 유리 코팅후 표면 촬영 86
3) CMC-DOPA 코팅 표면 분석 87
4) 효소에 의한 효소감응성 소재의 용출 간접적 확인; glucose 분석 88
5) Cellulase의 트랜스웰 멤브레인 침투 실험 89
(2세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 3: 각막 상피 세포의 중층배양 및 세포시트 형성법 연구 90
1) 세포시트 제작을 용이하게 하기 위한 기구 개발 90
2) 각막 상피 세포시트 형성 90
(2세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 4: 각막 상피 세포시트 이식용 지지체 개발 91
(2세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 5: 각막 내피세포의 세포시트 형성법 연구 인간 각막 내피세포 시트 제작 91
(2세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 6: 각막 내피 세포시트 이식용 지지체 개발 92
1) 젤라틴을 이용한 각막 내피 이식용 지지체 개발 92
2) PET 박막 멤브레인을 이용한 지지체 개발 93
3) polymer solution을 이용한 nano thin & highly porous membrane 제작 93
4) Plasma & sucrose coating 94
5) PET membrane에 세포 배양 95
(2세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 7: 각막 내피세포의 세포시트 형성법 연구 고강도 각막 기질층 조직재생법 연구 95
1) 인체 각막 keratocyte 세포 분리법 프로토콜 확립 95
2) Corneal keratocyte 검증 97
3) Human keratocyte의 Nanopattern dish 배양 97
4) Human keratocyte의 dECM 위에서의 배양 100
(2세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 8: 전층 각막 체외 배양용 바이오리액터 설계 및 제작 107
(2세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 9: 각막상피 세포 시트 형성법 최적화 및 제작 109
1) 각막상피시트 제작법 확립 109
2) 각막상피 세포시트 수축률 개선실험 112
3) 각막상피 세포시트 투명도 확인 113
(2세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 10: 인체 유래 각막 세포를 이용한 세포시트 형성법 최적화 및 제작 113
1) 각막세포시트 제조를 위한 효소 감응성 코팅소재 합성법 표준화, 양산방법 확립 113
2) CMC-DA coating한 plate에서 HCLE sheet 제작법 113
(2세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 11: 세포시트 및 기질층을 포함한 전층 각막 연구 114
1) 탈세포화 지지체 위에서 세포 배양법 최적화 114
2) 기질층을 포함한 전층 각막 재생 연구 115
3) 탈세포화 지지체 위에서의 각막 내피세포기능 유지 여부 확인 실험 116
(2세부과제/서울아산병원) 연구개발 내용 12: 전층 각막 체외 배양용 바이오리액터 개발 및 평가 117
1) 시작품 테스트 후 설계 변경 117
2) 바이오리액터 배지 주입 조절 118
4. 목표달성도 및 관련분야 기여도 125
4-1. 목표달성도 125
5. 연구결과의 활용계획 128
6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보[내용없음] 130
7. 연구개발성과의 보안등급 130
8. 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설·장비 현황[내용없음] 130
9. 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 131
10. 연구개발과제의 대표적 연구실적 132
11. 기타사항[내용없음] 132
12. 참고문헌 133
별첨[내용없음] 15
〈별첨1〉 자체평가의견서 15
〈별첨2〉 최종보고서 평가 면제요청서(매출액 달성) 15
〈별첨3〉 최종보고서 비공개 승인요청서 15
〈별첨4〉 실적 증빙자료 15
〈별첨5〉 기타 첨부서류 15
[뒷표지] 134