[표지] 1
연구진 2
목차 3
요약문 12
Abstract 14
I. 서론 16
1. 연구배경 16
가. 유전자변형생물체 동향 16
나. LMO 검출기술 개발 동향 29
다. 환경부 LMO 검출기술 개발 32
라. 제초제저항성 LMO 단백질 38
마. LMO 정성시험분야 국제공인시험기관 운영 41
바. 정부 LMO 정보공개 시스템 42
사. 생물다양성협약 카르타헤나의정서 주요 동향 45
II. 연구내용 및 방법 47
1. 신규 승인 LMO 단일검출법 개발 47
가. 단일검출법 개발 대상 이벤트 선정 47
나. 이벤트 도입유전자 구조 및 주변 염기서열 분석 48
다. 단일검출 프라이머 제작 51
라. Genomic DNA 분리 52
마. 유전자증폭 및 전기영동 53
바. 검출 특이도 검증 55
2. 최신 유전자검출 기술 적용 LM 카놀라 동시검출법 개발 56
가. 모세관 전기영동 활용 동시검출기술 개발 56
3. LM 면화 5종 고리매개 등온증폭기술 개발 59
가. 개발대상 이벤트 선정 및 DNA 추출 59
나. LAMP 프라이머 설계 및 반응액 조건 확립 61
다. LAMP 반응결과 확인 61
라. 특이도 및 민감도 검증 61
4. 제초제저항성 LMO 단백질 항체 개발 62
가. 제초제저항성 단백질 정제 및 분석 62
나. 제초제저항성 단백질 단클론항체 확보 63
5. 제초제저항성 간이면역 검사키트 개발 66
가. PAT, BAR 단백질 간이면역 검사키트 개발 66
III. 연구결과 69
1. 단일검출법 개발 69
가. 단일검출 프라이머 설계 69
나. 자체 단일검출법 검증 69
2. 최신 유전자검출 기술 적용 LM 카놀라 동시검출법 개발 78
가. 모세관 전기영동 장치 활용 동시검출법 개발 78
나. LM 카놀라 동시검출법 개발 결과 79
3. LM 면화 5종 LAMP 기술 개발 81
가. LM 면화 도입유전자 주변 염기서열 확보 81
나. LAMP 프라이머 설계 81
다. LM 면화 5종 LAMP 검출법 개발 84
라. LM 면화 검출용 LAMP 기술 결론 86
마. LAMP 기술 활용 모니터링 현장 LMO 유전자 분석 시스템 개발 86
4. 제초제저항성 LMO 단백질 항체 개발 88
가. PAT 단백질 대량정제 88
나. CP4 EPSPS 항체 제작용 펩타이드 제작 92
다. 제초제저항성 단백질 항체 최적화 연구 96
라. 제초제저항성 LMO 단백질 검사키트 개발 결론 105
5. 국제공인시험기관 운영 106
6. 정부 LMO 정보공개 시스템 분석 결과 107
가. 각 부처별 LMO 정보공개 홈페이지 구성 107
7. 환경부 LMO 연구시설 및 종사자 안전관리 110
가. 환경부 LMO 연구시설 안전관리 110
나. 환경부 LMO 생물안전관리 담당자 네트워크 구성 112
8. 생물다양성협약 당사국총회 대응 114
가. 샘플링, 검출 및 식별 온라인포럼 대응 114
나. 의제별 주요 논의 내용 114
IV. 고찰 및 제언 118
참고문헌 123
부록 127
표 1. 전세계 LM작물 승인현황('23.10월 기준) 16
표 2. EU 환경방출 실험 승인 현황('23.10월 기준) 25
표 3. 국립생태원 LMO 단일검출법 개발 현황('22.12월 기준) 33
표 4. LAMP 프라이머 예측 프로그램 비교 36
표 5. pat 유전자와 bar 유전자 특성비교 39
표 6. pat 유전자와 bar 유전자 비교 40
표 7. 국내 LMO 공인시험기관 현황('23. 11월 기준) 41
표 8. 국내 LMO 정보관리 홈페이지 42
표 9. LMO 단일검출법 개발 대상 이벤트 현황('23.11월 기준) 47
표 10. 단일검출법 대상 이벤트 정보 및 국내 승인 현황 49
표 11. 단일검출법 개발을 위한 내재유전자 및 프라이머 염기서열 52
표 12. 단일검출법 개발 대상 LMO 이벤트 표준물질 53
표 13. 단일검출 PCR 반응액 조성 54
표 14. 단일검출법 개발 대상 특이도 검증을 위한 LMO 표준물질 정보 56
표 15. 모세관 전기영동 동시검출용 프라이머 정보 57
표 16. 모세관 전기영동용 동시검출 PCR 반응액 조성 58
표 17. 모세관 전기영동 PCR 반응액 조성 59
표 18. LAMP 개발 5종 LM 면화 이벤트 정보 60
표 19. LAMP 개발에 사용된 LM 면화 인증표준물질 60
표 20. LM 면화 LAMP 증폭 반응액 조건 61
표 21. '23년 제초제저항성 단백질 항체 현황 64
표 22. 펩타이드 합성 조건 65
표 23. 펩타이드-BSA 접합체 분리 조건 66
표 24. 간이면역 검사키트 특이도 분석용 표준물질 목록 68
표 25. 단일검출법 대상 이벤트 프라이머 서열정보 70
표 26. LM 면화 5종 검출용 LAMP 프라이머 정보 83
표 27. PAT 항체 정제 결과 91
표 28. CP4 EPSPS 항원 예측 펩타이드 서열 94
표 29. CP4 EPSPS 항원 예측 펩타이드 정제 결과 95
표 30. BAR 간이면역 검사키트 최적조건(Capture antibody: #MBS478058/... 106
표 31. 2022년 국제숙련도시험 참가 결과 107
표 32. 정부 부처별 정보공개 홈페이지 하위 항목 구성 108
표 33. 환경부 소관 LMO 연구시설 현황('23.11월 기준) 110
표 34. 환경부 소관 LMO 생물안전교육 현황('23.11월 기준) 112
그림 1. 도입카세트 기반 LM 검출시 검출 가능 범위 30
그림 2. Lab-on-a-chip 기술이 적용된 LAMP kit 35
그림 3. LM 카놀라 5종 검출용 LAMP 기술 37
그림 4. PPT, PT, 글루타메이트 구조 비교 38
그림 5. PAT 단백질과 BAR 단백질의 유사도 비교 39
그림 6. 국내 승인 LMO 단일이벤트에 삽입된 제초제 저항성 유전자 종류... 40
그림 7. LM 옥수수 이벤트 도입유전자 및 모식도. (A) MON95379, (B)... 50
그림 8. LM 카놀라 이벤트 도입유전자 및 모식도. (A) NS-B50027-4, (B)... 51
그림 9. 단일검출법 개발 대상 LM 표준물질. (A) LM 옥수수... 53
그림 10. 단일검출법을 위한 PCR 반응조건. 향상된 시험 결과를 위해... 54
그림 11. 모세관 전기영동 기술 적용 LM 카놀라 동시검출기술 개발... 58
그림 12. PAT 항원 단백질의 간이면역 검사키트 반응성 확인. 상단 수... 66
그림 13. MON95379 단일검출법 개발 결과. Lane 1: 옥수수 내재유전자 Adh1 F... 71
그림 14. DP-023211-2 단일검출법 개발 결과. Lane 1: 옥수수 내재유전자... 72
그림 15. NS-B50027-4 단일검출법 개발 결과. Lane 1: 카놀라 내재유전... 73
그림 16. MON94100 단일검출법 개발 결과. Lane 1: 카놀라 내재유전자... 74
그림 17. LM 단일검출법 이벤트 특이도 검증 76
그림 18. '유전자변형 알팔파의 동시검출 방법' 지식재산권 확보 결과.... 78
그림 19. LM 카놀라 모세관 전기영동장치 활용 동시검출법 개발 결과... 80
그림 20. LM 면화 이벤트별 유전자 염기서열 및 LAMP 프라이머 결합... 82
그림 21. LM 면화 5종 LAMP 검출법 개발 84
그림 22. LM 면화 5종 LAMP 검출한계 검증 85
그림 23. LMO 조사현장 유전자분석 절차 87
그림 24. LMO 유전자 현장분석 시스템 홍보 영상(주소: https://www.youtube.com/... 88
그림 25. PAT 단백질 정제 및 순도 확인. Lane 정보(1: pellet, 2: resin... 89
그림 26. PAT 단백질 정제후 FPLC 결과 89
그림 27. 트립신 분해후 PAT 단백질 패턴. 각 peak는 PAT 단백질이 고... 90
그림 28. PAT 단백질 MASCOT 검색 결과. 빨간색 표시된 아미노산은... 90
그림 29. 자체 개발 PAT 항체 전기영동. Lane 정보(1: Protein Size... 91
그림 30. CP4-EPSPS의 2차원 구조 분석 92
그림 31. CP4-EPSPS의 3차원 구조 분석. (A) X-ray crystallography, (B)... 92
그림 32. CP4 EPSPS 항원 펩타이드 구조 93
그림 33. 펩타이드항체 제작용 노출 아미노산 구조 예측. PDB ID 2GG4... 93
그림 34. PAT 항체 gold conjugation 결과 96
그림 35. 자체 개발 PAT 항체 1차 페어링 테스트 결과. C: capture 항체,... 98
그림 36. 자체 개발 PAT 항체 1차 페어링 테스트 결과. C: capture... 99
그림 37. 자체 개발 PAT 항체 2차 페어링 테스트 결과. C: capture 항체,... 100
그림 38. 상용 PAT 항체 페어링 테스트 결과. C: capture 항체, D:... 101
그림 39. 상용 BAR 항체 페어링 테스트 결과. C: capture 항체, D:... 102
그림 40. 상용 BAR 항체 반응 버퍼 선정. C: capture 항체, D:... 103
그림 41. BAR 간이면역 검사키트 검출 시간 비교 104
그림 42. BAR 간이면역 검사키트 검출한계 비교. 상단 수치는 혼합비... 104
그림 43. BAR 간이면역 검사키트 최종 감도 비교 및 시제품 제작 105
그림 44. '23년 환경부 LMO 연구시설 안전점검(좌: 국립낙동강생물자... 110
그림 45. '23년 환경부 LMO 연구시설 사고예방 활동 사례(좌: 개선전,... 111
그림 46. '23년 환경부 LMO 생물안전책임자 워크숍 보도자료 113