[표지] 1

연구진 2

목차 3

요약문 10

Abstract 11

I. 서론 12

1. 합성생물학과 유전자가위의 등장 12

2. 유전자가위기술 국가별 규제 프레임워크 17

3. 바이오신기술 LMO와 환경정책 20

II. 연구내용 및 방법 23

1. 환경부 신기술 LMO 사전검토제 항목 분석 23

2. 신기술 LMO 사전검토제 지표 개선(안) 발굴 23

가. 기존 및 신기술 LMO 외래유전자 도입 여부 분석 23

나. 최종 산물의 기능 및 상세 정보 항목 개선(안) 제시 23

3. 국내외 LM 식물 연구 및 환경방출 위해성평가 동향 분석 28

가. 국내·외 LM 식물 개발·연구 및 환경방출 사례 분석 28

나. 환경정화용 LM 식물 위해성평가 자료 및 항목 분석 30

4. 환경정화용 LM 식물(목본) 개발 기술 확보 및 형질전환 31

가. 환경정화용 LMO(포플러 등) 개발을 위한 도입유전자 선정 31

나. 환경정화용 LM 식물 제작을 위한 도입유전자 Cloning 33

다. 환경정화용 LM 식물(포플러 등) 개발을 위한 형질전환 기술 확보 35

라. LM 식물 우성형질 선별을 genomic DNA 추출 및 sequencing 분석 39

5. LMO 생산공정이용시설 안전관리 방안 분석 40

6. 환경부 LMO 연구실 안전관리 표준 고도화 및 보급 40

가. LMO 연구실 사전유해인자위험분석 보고서 작성 방법 및 매뉴얼 개발 40

나. LMO 안전관리 우수연구실 유지 및 연구실 안전관리 컨설팅 방법 41

III. 연구 결과 42

1. 국가/국제기구별 신기술 LMO 사전검토제 항목 분석 42

2. 신기술 LMO 사전검토제 지표 개선(안) 발굴 52

가. 기존 및 신기술 LMO 외래유전자 도입 여부 분석 52

나. 최종 산물의 기능 및 상세 정보 항목 개선(안) 제시 56

3. 국내외 LM 식물 연구 및 환경방출 위해성평가 동향 분석 63

가. 국내·외 유전자편집기술 LM 식물 개발 현황 63

나. 국내·외 환경정화용 LM 식물 개발·연구 동향 66

다. 환경정화용 LM 식물 위해성평가 자료 및 항목 분석 67

4. 환경정화용 LM 식물(목본) 개발 기술 확보 및 형질전환 67

가. 환경정화용 LM 포플러 개발을 위한 도입유전자 선정 67

나. 환경정화용 LM 식물(목본) 개발을 위한 유전자 클로닝 69

다. 환경정화용 LM 식물 형질전환 및 우성형질 선별 72

5. 신기술 LMO 대응을 위한 환경부 생산공정이용시설 안전관리 방안 발굴 81

6. 환경부 LMO 연구실 안전관리 표준 고도화 및 보급 89

가. LMO 연구실 사전유해인자위험분석 보고서 작성 방법 및 매뉴얼 개발 89

나. LMO 안전관리 우수연구실 유지 및 연구실 안전관리 컨설팅 91

IV. 고찰 및 제언 92

참고문헌 97

부록 109

표 1. 유전자가위 세대별 비교 16

표 2. CRISPR 시스템에 활용되는 Cas 단백질과 그 기능 16

표 3. 본 과제에서 개발한 신기술 이용 LMO 현황(2016-2022) 24

표 4. 도입유전자 OST2 가이드 RNA 염기서열 26

표 5. 국내외 환경정화용 LMO 개발에 도입된 유전자 현황 31

표 6. 포플러 형질전환 시기별 배지 조성 36

표 7. 목표 유전자 확인을 위한 Primer 서열 40

표 8. 국가별 유전자편집기술 규제 면제를 위한 요청 항목 비교 50

표 9. 유전자가위 기술 이용 LM 포플러, 애기장대 개발을 위한 PagABCG22,... 70

표 10. 산업적 활용을 위한 신기술 이용 LMO 연구현황 82

표 11. 신기술 이용 음료 및 식품 생산 LMO 개발 현황 83

표 12. 생산공정이용시설 유전자변형미생물의 위해성심사 비교 84

표 13. 부처별 유전자변형미생물 생산공정이용시설 통합고시 비교 85

표 14. 생산공정1등급시설 이용 유전자변형미생물의 위해성심사 자료 제출... 87

표 15. 연구실 안전 보고서 개선 90

표 16. 우수연구실 및 최우수 연구실 선정 인증서 91

그림 1. 합성생물학의 COP 13 및 COP-MOP 8을 위한 주요 결정 13

그림 2. NEDO 'SMARTCELL PROJECT' 소개 14

그림 3. 합성생물학의 환경 분야 활용 15

그림 4. National Commitee on Biosafety of Philippines(NCBP)에서 제공한... 18

그림 5. NEDO SMARTCELL PROJECT에서 제공하는 합성생물학... 20

그림 6. 일본 정부의 지원을 통해 개발된 생분해성 플라스틱 생산... 20

그림 7. 유럽연합의 'Farm to Fork'... 21

그림 8. OST2 target sequence 가이드 RNA 디자인 26

그림 9. 미국의 기후변화 대응 LM 포플러 개발 사례... 29

그림 10. YCF1 과발현 포플러의 광산 정화 환경방출 실험 사례 33

그림 11. AtABCG22 K/O 애기장대의 높은 증산 효과 사례 33

그림 12. pCAMBIA1302::YCF1 Cloning 방법 34

그림 13. 유전자가위 기술 이용 pAGM4723::PagABCG22... 35

그림 14. 포플러 형질전환 모식도 37

그림 15. 애기장대 형질전환 모식도 38

그림 16. 일본 유전자편집 LMO의 사전검토항목 43

그림 17. 일본 환경성이 제공한 유전자편집 LMO에 대한 규제... 44

그림 18. 미국 USDA의 유전자편집 식물에 대한 규제 프로세스 45

그림 19. 아르헨티나의 유전자편집 기술에 대한 규제 프로세스 46

그림 20. 유럽 EFSA 저널에서 발표한 표적돌연변이,... 47

그림 21. 인도 정부의 유전자편집 식물에 대한 규제 프로세스 48

그림 22. 브라질의 유전자편집 제품에 대한 규제 프로세스 49

그림 23. Southern blot 실험 방법 53

그림 24. Agrivida사가 USDA APHIS에 제출한 LM 옥수수 이벤트 PY203의... 53

그림 25. 현대생명공학기술을 이용한 LMO 개발 및 LMO 규제 여부 54

그림 26. CRISPR/Cas9으로 개발된 유전자변형 벼의 sgRNA 잔존유무... 55

그림 27. CRISPR/Cas9으로 개발된 유전자변형 유글레나의 sgRNA 잔존유무... 56

그림 28. 유전자가위 기술 이용 OST2 sgRNA... 56

그림 29. OST2 Level 1 Cloning 결과 57

그림 30. OST2 Level 2 Cloning 결과 57

그림 31. OST2 Cloning 염기서열 확인 58

그림 32. OST2 유전자 교정 애기장대 형질전환 과정 59

그림 33. 항생제 배지에서 선별 중인 OST2 유전자... 59

그림 34. Sanger sequencing과 NGS의 비교 60

그림 35. 단일가닥 형태적 다형성기법(Polymerase chain... 61

그림 36. 기개발된 유전자가위 적용 LMO의 T7E1 처리 및 On-target 분석 62

그림 37. 차세대 염기서열 분석 기반 off-target mutagenesis 탐지 63

그림 38. 국제 신기술 LMO의 이용승인 및 상업화 현황 63

그림 39. 신기술 LMO 기술별 이용승인 및 상업화 현황 64

그림 40. 국가별 신기술 LMO 연구·이용승인·상업화 현황 64

그림 41. 국가별 신기술 LMO에 대한 분류 현황 65

그림 42. YCF1 증폭을 위한 PCR... 69

그림 43. 과발현 벡터에 클로닝 후 YCF1 염기서열 분석 결과 69

그림 44. pCAMBIC1302::YCF1 Cloning 확인 70

그림 45. 유전자가위 기술 이용 PagABCG22 및 AtABCG22 sgRNA... 71

그림 46. Level 1 Cloning 결과 (A) 포플러 (B) 애기장대 71

그림 47. Level 2 Cloning 결과 (A) 포플러 (B) 애기장대 72

그림 48. 6주 기내 배양한 야생형 포플러 72

그림 49. 아그로박테리움 배양 및 포플러 형질전환 73

그림 50. 형질전환 후 캘러스 유도 배지에서 배양 (A)... 73

그림 51. PagABCG22 형질전환 포플러 캘러스... 74

그림 52. YCF1 형질전환 포플러 캘러스 유도... 74

그림 53. YCF1 형질전환 포플러 신초 유도 확인... 75

그림 54. YCF1 형질전환 포플러 신초 유도 후 시기별 사진 75

그림 55. YCF1 형질전환 포플러 발근 유도 76

그림 56. 아그로박테리움 배양 및 애기장대 형질전환 과정 77

그림 57. 흙으로 옮겨 심은 선별된 LM 애기장대 (A) YCF1 과발현... 78

그림 58. YCF1 과발현 LM 애기장대 PCR 결과(WT는 야생형) 78

그림 59. YCF1 과발현 LM 애기장대 염기서열 분석 결과 79

그림 60. AtABCG22 유전자 교정 LM 애기장대 PCR 결과 79

그림 61. AtABCG22 유전자 교정 LM 애기장대 염기서열 분석 결과 80

그림 62. LM 애기장대 T1세대 종자 확보 (A) YCF1 과발현 LM 애기장대... 80

그림 63. LM 애기장대 T2세대 우성형질 선별 과정 (A) ABCG22... 81