[표지] 1
자체 연구개발과제 최종보고서 제출문 2
국문 요약문 4
Summary 6
목차 8
제1장 연구개발과제의 개요 16
제1절 연구개발과제의 목표 16
제2절 연구개발과제의 필요성 16
제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발현황 23
제1절 국내외 암 발생 현황 23
1. 국내 암 발생 현황 23
2. 국외 암 발생 현황 28
제2절 항암제 개발 현황 29
제3절 오가노이드 개발 현황 34
제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 36
제1절 후보 생체지표 선정 및 문헌 조사 37
1. 후보 생체지표 기능 및 연구 동향 37
제2절 in vitro 실험을 위한 세포주 선정 및 실험 조건 확립 44
1. 선행 발굴 5-FU 생체지표의 특성 분석 시험 44
제3절 in vitro 실험을 위한 유전자 변형 세포주 구축 58
1. 유전자 변형 세포주 제작 및 5-FU 처리에 의한 특성 분석 시험 58
제4절 3차원 배양 세포주를 활용한 in vitro 모델 시험 75
1. 3D 스페로이드를 이용한 5-FU 생체지표 유전자 변형 세포의 특성 분석 시험 75
제5절 환자 유래 대장암 오가노이드 및 암 연관 섬유아세포의 확립 및 특성 분석 110
1. 환자 유래 대장암 오가노이드의 확립 및 특성 분석 110
2. 환자 유래 암 연관 섬유아세포의 세포주 확립 124
제6절 환자 유래 암 오가노이드 및 단독 배양 모델 시험 132
1. 오가노이드 선정 방법 132
2. 5-FU 처리에 따른 오가노이드의 생체지표 단백질 발현 141
제7절 환자 유래 암 오가노이드 및 암 연관 섬유아세포의 공배양 모델 시험 163
1. 공배양을 위한 오가노이드 선정 실험 163
2. 섬유아세포 선정 실험 165
3. 오가노이드의 암 연관 섬유아세포 공배양시 특성 분석 시험 170
제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 187
제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 190
제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 191
제7장 참고문헌 194
제8장 첨부서류 201
[뒷표지] 208
〈표 1〉 내성이 발생한 대표적 화학 및 표적항암제 17
〈표 2〉 생체지표자 종류와 특징 19
〈표 3〉 암 연구에서 사용된 biomarker 20
〈표 4〉 기대수명까지 생존 시의 암 발생 위험 23
〈표 5〉 주요 암종 암발생 현황, 2019 24
〈표 6〉 연령군별 주요 암 발생율, 2019 25
〈표 7〉 암종별 사망률 추이, 2011-2021 27
〈표 8〉 주요암의 연령표준화발생율 국제 비교, 2019 28
〈표 9〉 대장암 치료에 이용되는 국내 식약처 승인 약물 및 조합 29
〈표 10〉 대장암 치료에 이용되는 FDA 승인 약물 30
〈표 11〉 대장암 치료에 이용되는 약물 조합 31
〈표 12〉 국내 오가노이드 전문가 초청 세미나 내역 35
〈표 13〉 5-FU 내성 기전 확인을 위해 구축한 4가지 세포 배양 방법 36
〈표 14〉 선행연구에서 발굴된 생체지표 단백질(SCLY, IMMT, EZR)의 역할 37
〈표 15〉 EZR(Ezrin)의 연구동향 38
〈표 16〉 IMMT(Mitofilin)의 연구동향 40
〈표 17〉 SCLY의 연구동향 41
〈표 18〉 Western blot에 사용한 항체 정보 51
〈표 19〉 Real-time PCR 온도 및 시간 설정 54
〈표 20〉 생체지표 후보 정보 58
〈표 21〉 생체지표 검정 및 교정 내역 59
〈표 22〉 완성된 과발현 생체지표 정보 59
〈표 23〉 발현 저하 생체지표 정보 59
〈표 24〉 유전자 변형을 위한 Plasmid DNA 정보 61
〈표 25〉 Western blot에 사용한 항체 정보 63
〈표 26〉 Real-time PCR 온도 및 시간 설정 65
〈표 27〉 Lentivirus 벡터를 이용한 HEK293T transfection 조건 68
〈표 28〉 5-FU처리에 의한 유전자 과발현 변형 세포주 스페로이드 표본 정보 83
〈표 29〉 5-FU처리에 의한 유전자 발현억제 변형 세포주 스페로이드 표본 정보 83
〈표 30〉 First Strand cDNA의 합성에 필요한 시료(1) 85
〈표 31〉 First Strand cDNA의 합성에 필요한 시료(2) 86
〈표 32〉 PCR을 이용한 First Strand cDNA의 합성 절차 86
〈표 33〉 First Strand cDNA의 합성에 필요한 시료 86
〈표 34〉 cDNA Library를 위해 mixture의 제조 87
〈표 35〉 cDNA Library를 위해 PCR 조건 88
〈표 36〉 Adaptor Ligation에 필요한 mixture의 제조 88
〈표 37〉 RNA Library에 필요한 mixture 제조 89
〈표 38〉 RNA Library 합성을 위한 PCR 조건(1) 90
〈표 39〉 RNA Library 합성을 위한 PCR 조건(2) 90
〈표 40〉 발굴된 EZR 하위 유전자에 대한 정보 101
〈표 41〉 발굴된 IMMT 하위유전자에 대한 정보 102
〈표 42〉 발굴된 SCLY 하위유전자에 대한 정보 103
〈표 43〉 확보한 대장암 종양조직 및 임상정보(14례) 111
〈표 44〉 확보한 대장암 종양 조직의 병변 위치 112
〈표 45〉 암 오가노이드 배양액 조성 120
〈표 46〉 확보한 대장암 종양 조직 및 임상 정보 121
〈표 47〉 암 연관 섬유아세포 및 일반 섬유아세포 확보를 위한 종양 조직 정보 및 임상정보 124
〈표 48〉 섬유아세포 배양액 조성 129
〈표 49〉 확보한 대장암 종양 조직 및 암 연관 섬유아세포주 130
〈표 50〉 확보한 환자 유래 정상 섬유아세포주 131
〈표 51〉 각 오가노이드의 5-FU 처리에 따른 IC₅₀ 확인 139
〈표 52〉 Z-score 산출공식 140
〈표 53〉 Western blot에 사용되는 buffer 조성 175
〈표 54〉 Western blot에 사용한 항체 정보 175
〈표 55〉 선별된 싸이토카인 정보 182
〈그림 1〉 국내 사망원인 순위 추이 26
〈그림 2〉 암 사망률 추이, 1983-2021 27
〈그림 3〉 5-FU의 약리기전 31
〈그림 4〉 환자 유래 세포주와 환자 세포의 이종 이식, 오가노이드의 비교 35
〈그림 5〉 EZR의 FAK/AKT 신호전달경로 38
〈그림 6〉 EZR의 protein-protein interaction 39
〈그림 7〉 IMMT의 protein-protein interaction 40
〈그림 8〉 SCLY의 항산화 및 산화 스트레스 관련 신호전달경로1 41
〈그림 9〉 SCLY의 항산화 및 산화 스트레스 관련 신호전달경로2 42
〈그림 10〉 SCLY의 protein-protein interaction 43
〈그림 11〉 각 세포의 5FU 처리 농도에 대한 반응 결과 45
〈그림 12〉 약물 반응곡선의 IC₅₀ 확인 47
〈그림 13〉 각 세포의 5-FU 처리 농도에 대한 IC₅₀ 결과 48
〈그림 14〉 대장암 세포주 7종에 따른 생체지표의 단백질 발현 양상 52
〈그림 15〉 대장암 세포주 7종에 따른 생체지표 유전자 발현 양상 54
〈그림 16〉 대장암 세포주 7종에 따른 생체지표 유전자 발현 양상 56
〈그림 17〉 각 대장암 세포주 별 생체지표 유전자 발현 양상 57
〈그림 18〉 유전자 형질전환 단백질 발현 측정 63
〈그림 19〉 EZR 발현 조절 세포 mRNA 발현 66
〈그림 20〉 IMMT 발현 조절 세포 mRNA 발현 66
〈그림 21〉 SCLY 발현 조절 세포 mRNA 발현 67
〈그림 22〉 유전자 변형 HCT116 세포의 단백질 발현 68
〈그림 23〉 유전자 변형 HCT116 세포에서의 후보 생체지표 유전자 과발현 69
〈그림 24〉 유전자 변형 HCT116 세포에서의 후보 생체지표 유전자 발현 억제 70
〈그림 25〉 유전자 변형 SW480 세포에서의 후보 생체지표 유전자 발현 억제 70
〈그림 26〉 유전자 변형 SW480 세포에서의 후보 생체지표 유전자 과발현 71
〈그림 27〉 유전자 변형 SW480 세포에서의 후보 생체지표 유전자 발현억제 72
〈그림 28〉 유전자 변형 HCT116 세포에서 5-FU 약물 반응 확인... 74
〈그림 29〉 유전자 변형 HCT116 세포에서 5-FU 약물 반응 확인... 75
〈그림 30〉 유전자 변형 세포주를 이용한 스페로이드 형성 모식도 75
〈그림 31〉 각 대장암의 3차원적 세포주 형태 77
〈그림 32〉 3차원적 세포의 5-FU 약물 반응 확인 79
〈그림 33〉 3차원적 유전자 과발현 변형 세포주의 5-FU에 대한 약물 반응 81
〈그림 34〉 5-FU처리에 의한 유전자 과발현 변형 세포주에서의 스페로이드 지름 변화 81
〈그림 35〉 3차원적 유전자 발현억제 변형 세포주의 5-FU에 대한 약물 반응 82
〈그림 36〉 5-FU처리에 의한 유전자 발현억제 변형 세포주에서의 스페로이드 지름 변화 82
〈그림 37〉 Agilent 2100 Bioanalyzer의 Electropherogram 예시 결과 91
〈그림 38〉 전사체 분석 과정 92
〈그림 39〉 차등 발현 유전자 히트맵 93
〈그림 40〉 발현 경향성에 따른 clustering 결과 94
〈그림 41〉 Cluster 1 Gene Set Enrichment 분석 95
〈그림 42〉 Cluster 4 Gene Set Enrichment 분석 95
〈그림 43〉 Cluster 1과 114개 암연관 유전자와의 PPI 분석 96
〈그림 44〉 Cluster 4와 114개 암연관 유전자와의 PPI 분석 97
〈그림 45〉 5-FU 약물 처리에 따라 상향조절 또는 하향조절되는 EZR의 하위유전자의 수 98
〈그림 46〉 5-FU 약물 처리에 따라 상향조절 또는 하향조절되는 IMMT의 하위유전자 99
〈그림 47〉 5-FU 약물 처리에 따라 상향조절 또는 하향조절되는 SCLY의 하위유전자 100
〈그림 48〉 5-FU 처리에 따라 반대로 조절되는 EZR 하위유전자 101
〈그림 49〉 5-FU 처리에 따라 반대로 조절되는 IMMT 하위유전자 102
〈그림 50〉 5-FU 처리에 따라 반대로 조절되는 SCLY 하위유전자 103
〈그림 51〉 생체지표 및 하위인자 유전자 발현 분석 104
〈그림 52〉 유전자 발현에 따른 대장암 환자의 생존 분석율 106
〈그림 53〉 대장암진료권고안의 대장암 병기 I, II, III에 따른 결장암 치료 전략도 110
〈그림 54〉 환자 유래 대장암 오가노이드 확립 방법 115
〈그림 55〉 대장암 유래 1차세포 배양과 암 연관 섬유아세포 배양 방법 126
〈그림 56〉 오가노이드의 5-FU 처리 및 분석 방법 132
〈그림 57〉 Calcein-AM assay 원리 132
〈그림 58〉 오가노이드의 각 농도별 5-FU 처리에 따른 세포 생존율 확인 133
〈그림 59〉 약물 반응곡선의 IC₅₀ 확인 136
〈그림 60〉 오가노이드의 각 농도별 5-FU 처리에 따른 반응곡선 136
〈그림 61〉 각 오가노이드의 5-FU 처리에 따른 IC₅₀ 확인 140
〈그림 62〉 오가노이드 13종의 Anti-Ezrin과 Anti-IFIT3 이중형광염색 143
〈그림 63〉 오가노이드 13종의 Anti-IMMT와 Anti-MMP7 이중형광염색 149
〈그림 64〉 오가노이드 13종의 Anti-SCLY와 Anti-IRF7 이중형광염색 156
〈그림 65〉 오가노이드 6종 면역화학염색 결과, 대장암 특이적 분자 마커 163
〈그림 66〉 오가노이드 6종 면역화학염색 결과, 생체지표 및 하위인자 164
〈그림 67〉 각 섬유아세포의 5-FU 처리 농도에 대한 IC₅₀ 결과 166
〈그림 68〉 2T 오가노이드의 공배양시 5-FU 약물에 따른 세포 생존율 결과 170
〈그림 69〉 429T 오가노이드의 공배양시 5-FU 약물에 따른 세포 생존율 결과 172
〈그림 70〉 환자 유래 오가노이드-암 연관 섬유아세포 공배양 모델의... 176
〈그림 71〉 5-FU에 의한 환자 유래 오가노이드-암 연관 섬유아세포 공배양 모델... 177
〈그림 72〉 싸이토카인 어레이 절차 178
〈그림 73〉 2T 싸이토카인 어레이 결과 179
〈그림 74〉 429T 싸이토카인 어레이 결과 179
〈그림 75〉 2T 싸이토카인 발현 히트맵 180
〈그림 76〉 429T 싸이토카인 발현 히트맵 181
〈그림 77〉 2T, 429T 싸이토카인 벤다이어그램 182
〈그림 78〉 2T 싸이토카인 발현양상 184
〈그림 79〉 429T 싸이토카인 발현양상 185
〈그림 80〉 내성 관련 사이토카인과 생체지표 및 하위인자 간 PPI 분석 결과 186