[표지] 1
자체연구개발과제 최종보고서 제출문 2
국문 요약문 4
목차 5
제1장 연구개발과제의 개요 13
제1절 연구개발과제의 목표 13
1. 연구개발의 최종 목표 13
2. 연차별 연구개발 목표 13
제2절 연구개발과제의 필요성 14
1. 소량 음용수, 식품용수(지하수) 중 식중독바이러스 검출법 개발 14
2. 노로바이러스 RT-PCR 유전자 검출효율 향상 연구 22
제2장 연구개발과제의 국내·외 연구개발 현황 24
제1절 국대 연구개발 현황 24
1. 소량 음용수, 식품용수(지하수) 중 식중독바이러스 검출법 개발 24
제2절 국외 연구개발 현황 26
1. 소량 음용수, 식품용수(지하수) 중 식중독바이러스 검출법 개발 26
제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 36
제1절 소량 음용수 중 바이러스 검출을 위한 시험법 선정 36
1. 국내외 시험법 조사를 통한 시험법 선정 36
2. 소량 음용수 중 바이러스 검출 시험법 개발 workflow 36
제2절 재료 및 방법 37
1. 소량 음용수 중 식중독 바이러스 검출을 위한 시험법 개발 37
2. 노로바이러스 유전자 시험법 개선 69
3. 노로바이러스 유전자 증폭 부위 개선(RFP 외 추가도출) 83
제3절 연구결과 92
1. 소량 음용수 중 식중독 바이러스 검출을 위한 시험법 개발 결과 92
2. 노로바이러스 유전자 시험법 개선 결과 107
3. 노로바이러스 유전자 증폭 부위별 검출 효율 비교 결과(RFP 외 추가도출) 115
제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 128
제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 131
제6장 연구개발과제의 연구개발 결과 활용계획 132
제1절 연구성과 132
1. 현장전문 인력 교육 실적 133
2. 학술발표 133
3. 시험분석법 개발 건수 133
4. 민간포상 133
제2절 총괄활용계획 134
1. 기타 정책 활용 134
2. 현장전문 인력 교육 실적 134
3. 연구성과 소통확산 정도 134
4. 국내외 기관 협력 정도 134
5. 학술성과 134
제7장 참고문헌 135
[뒷표지] 140
표 1. 국내외 수인성바이러스 집단감염 사례 19
표 2. 물 관련 수인성·식품매개바이러스 검사법 국내 현황 21
표 3. 국내 물 중 바이러스의 검출 연구개발 현황 24
표 4. 국외 식품용수 중 장관계 바이러스의 검출 연구개발 현황 26
표 5. 과거의 바이러스 농축 방법 및 장단점 28
표 6. 바이러스 필터 종류 및 장단점 29
표 7. 탈리 용액 종류 및 장단점 31
표 8. 탈리 용액 적용 예시 31
표 9. 농축 방법별 장단점 33
표 10. 농축 방법 적용 예시 34
표 11. 시험법 1 필터, 탈리용액 및 농축조건 44
표 12. 탈리액 조성 44
표 13. A형 간염바이러스의 RT-qPCR 조성 56
표 14. A형 간염바이러스 RT-qPCR primer와 probe의 염기서열 56
표 15. A형 간염바이러스 RT-qPCR 반응조건 57
표 16. 로타바이러스 RT-qPCR 조성 57
표 17. 로타바이러스 RT-qPCR의 primer와 probe의 염기서열 58
표 18. 로타바이러스 RT-qPCR 반응조건 58
표 19. 뮤린노로바이러스 RT-qPCR 조성 59
표 20. A형 간염바이러스 RT-qPCR primer와 probe의 염기서열 59
표 21. A형 간염바이러스 RT-PCR 조성 60
표 22. A형 간염바이러스 RT-PCR primer 염기서열 60
표 23. A형 간염바이러스 RT-PCR 반응조건 60
표 24. A형 간염바이러스 Nested PCR 조성 61
표 25. A형 간염바이러스 Nested PCR primer 염기서열 61
표 26. A형 간염바이러스 Nested PCR 반응조건 61
표 27. 로타바이러스 RT-PCR 조성 62
표 28. 로타바이러스 RT-PCR primer 염기서열 62
표 29. 로타바이러스 RT-PCR 반응조건 63
표 30. 로타바이러스 VP7 Multiplex PCR 조성 63
표 31. 로타바이러스 Nested PCR primer 염기서열 64
표 32. A형 간염바이러스 Nested PCR 반응조건 64
표 33. 뮤린노로바이러스 RT-PCR 조성 65
표 34. 뮤린노로바이러스 RT-PCR primer 염기서열 65
표 35. 뮤린노로바이러스 RT-PCR 반응조건 65
표 36. 뮤린노로바이러스 Nested PCR 조성 66
표 37. 뮤린노로바이러스 Nested PCR primer 염기서열 66
표 38. 뮤린노로바이러스 Nested PCR 반응조건 66
표 39. 국내·외 RT-qPCR 및 RT-PCR 관련 시약 선정 69
표 40. 노로바이러스 양성대조군 RT-qPCR primer와 probe의 염기서열 69
표 41. 노로바이러스 양성대조군 RT-qPCR 반응조건 70
표 42. G사 시약의 RT-qPCR 조성 70
표 43. E사 시약의 RT-qPCR 조성 71
표 44. F사 시약의 RT-qPCR 조성 72
표 45. D사 시약의 RT-qPCR 조성 72
표 46. C사 시약의 RT-qPCR 조성 73
표 47. B사 시약의 RT-qPCR 조성 74
표 48. 노로바이러스 양성대조군 RT-PCR primer 염기서열 75
표 49. 노로바이러스 양성대조군 One-Step RT-PCR 반응조건 75
표 50. G사 시약의 One-Step RT-PCR 반응액 조성 76
표 51. G사 시약의 Semi-nested RT-PCR 반응액 조성 76
표 52. E사 시약의 One-Step RT-PCR 반응액 조성 77
표 53. E사 시약의 Semi-nested RT-PCR 반응액 조성 77
표 54. F사 시약의 One-Step RT-PCR 반응액 조성 78
표 55. F사 시약의 Semi-nested RT-PCR 반응액 조성 78
표 56. D사 시약의 One-Step RT-PCR 반응액 조성 79
표 57. D사 시약의 Semi-nested RT-PCR 반응액 조성 79
표 58. C사 시약의 One-Step RT-PCR 반응액 조성 80
표 59. C사 시약의 Semi-nested RT-PCR 반응액 조성 80
표 60. B사 시약의 One-Step RT-PCR 반응액 조성 81
표 61. B사 시약의 Semi-nested RT-PCR 반응액 조성 81
표 62. 노로바이러스 양성 대조군 Semi-nested RT-PCR 반응조건 81
표 63. 노로바이러스 유전자형 결정 증폭부위 시험법 84
표 64. 시험법 1의 RT-PCR 조성 86
표 65. 시험법 1의 RT-PCR primer 염기서열 86
표 66. 시험법 1의 RT-PCR 반응조건 86
표 67. 시험법 2의 RT-PCR 조성 87
표 68. 시험법 2의 RT-PCR primer 염기서열 87
표 69. 시험법 2의 RT-PCR 반응조건 88
표 70. 시험법 2의 semi-nested PCR 조성 88
표 71. 시험법 2의 semi-nested PCR primer 염기서열 89
표 72. 시험법 2의 semi-nested PCR 반응조건 89
표 73. 시험법 3의 RT-PCR 조성 90
표 74. 시험법 3의 RT-PCR primer 염기서열 90
표 75. 시험법 3의 RT-PCR 반응조건 90
표 76. 시험법 3의 semi-nested PCR 조성 91
표 77. 시험법 3의 semi-nested PCR 반응조건 91
표 78. 탈리액-농축방법 별 RT-PCR 검출 결과 99
표 79. 노로바이러스 GI 양성대조군을 활용한 RT-qPCR 검출효율 비교 107
표 80. 노로바이러스 GII 양성대조군을 활용한 RT-qPCR 검출효율 비교 108
표 81. 노로바이러스 Duplex RT-qPCR 반응액 조성 115
표 82. 노로바이러스 Duplex RT -qPCR의 primer와 probe의 염기서열 116
표 83. 노로바이러스 One-step RT-PCR 반응액 조성 117
표 84. 노로바이러스 One-step RT-PCR 반응조건 및 온도 117
표 85. 노로바이러스 Semi-nested PCR 반응액 조성 118
표 86. 노로바이러스 Semi-nested PCR 반응조건 및 온도 118
표 87. 노로바이러스 PCR primer 염기서열 119
표 88. 노로바이러스 RT-qPCR 반응액 조성 120
표 89. 노로바이러스 Duplex RT-qPCR의 primer와 probe의 염기서열 121
표 90. 노로바이러스 RT-PCR Master mix 1 조성 123
표 91. 노로바이러스 RT-PCR Master mix 2 조성 123
표 92. 노로바이러스 GIA, GIB Real-time PCR 반응액 조성 124
표 93. 노로바이러스 GII Real-time PCR 반응액 조성 124
표 94. 노로바이러스 RT-qPCR의 primer와 probe의 염기서열 124
표 95. 노로바이러스 Conventional PCR의 primer 염기서열 125
표 96. 노로바이러스 RT-qPCR 반응액 조성 126
표 97. 노로바이러스 RT-qPCR의 primer와 probe의 염기서열 126
그림 1. 연도별 노로바이러스 환자 및 발생건수 14
그림 2. A형 간염바이러스 유전자 구조 15
그림 3. 로타바이러스의 유전자 구조 16
그림 4. 아스트로바이러스의 유전자 구조 16
그림 5. 아데노바이러스 유전자 구조 17
그림 6. E형 간염바이러스의 유전자 구조 18
그림 7. 2020~2021년 식중독바이러스 검출 건수 18
그림 8. 식중독바이러스 주요 오염경로 18
그림 9. 음용수 중 바이러스 검출 및 식중독 발생 사례 20
그림 10. 식품용수 식중독바이러스 분석 절차 21
그림 11. 노로바이러스 유전자 그룹(GI-GX) 22
그림 12. 물에 존재하는 노로바이러스 검출 흐름도 25
그림 13. 물에 존재하는 장관계 바이러스 검출법 25
그림 14. 물에 존재하는 장관계 바이러스 검출법 개발 흐름도 27
그림 15. 물에 존재하는 노로바이러스 검출법 27
그림 16. 음전하 필터 종류. A: Millipore membrane filter, B: Balston filter... 29
그림 17. 양전하 필터 종류. A: Virosorb 1MDS cartridge filter, B:... 30
그림 18. 소량 음용수 중 바이러스 검출 시험법 개발 workflow 36
그림 19. FRhK-4 계대배양 전 38
그림 20. A형 간염바이러스 접종 6일 후 FRhK-4세포 38
그림 21. MA104 계대배양 전 39
그림 22. 로타바이러스 접종 2일 후 MA104 세포 40
그림 23. RAW 264.7 계대배양 전 41
그림 24. 뮤린노로바이러스 접종 2일 후 RAW264.7 세포 42
그림 25. 시험법 1 바이러스 부착,탈리 및 농축 방법 49
그림 26. 시험법 1 flow chart 49
그림 27. 시험법 2 flow chart 51
그림 28. 시험법 3 flow chart 53
그림 29. 여액 시간 횟수별 유전자 증폭 결과 (1) 5.34 × 10⁸ copy/L 시험용액 RT qPCR 결과... 93
그림 30. 여액 흡착 횟수별 유전자 증폭 결과 (1) 5.34 × 10⁸ copy/L 시험용액... 93
그림 31. 여액 흡착 횟수별 유전자 증폭 결과 (1) 5.34 × 10⁸ copy/L 시험용액... 94
그림 32. 탈리액 용량별 RT-PCR 결과 100
그림 33. 뮤린노로바이러스에 시험법 1 적용 결과 104
그림 34. 뮤린노로바이러스에 시험법 2 적용 결과 105
그림 35. 뮤린노로바이러스에 시험법 3 적용 결과 106
그림 36. 노로바이러스 양성대조군 GI의 시약별 검출한계 결과 110
그림 37. 노로바이러스 양성대조군 GII의 시약별 검출한계 결과 111
그림 38. D사 PCR product를 주형으로 semi-nested PCR을 진행한 노로바이러스 GI 양성... 112
그림 39. D사 PCR product를 주형으로 semi-nested PCR을 진행한 노로바이러스 GII 양성... 113
그림 40. 현행 시약으로 증폭되지 않았던 음용수 및 조리용수에서 분리된 GII.2 적용결과 114
그림 41. EPA 노로바이러스 RT-qPCR 검출법 모식도 122
그림 42. 노로바이러스 유전자형 결정을 위한 유전자 증폭법 비교 결과 127
그림 43. 유전자형 결정부위 시험법(안) 127