목차
보고서 요약서 2
요약문 3
SUMMARY 4
제1장 연구개발과제의 개요 7
1. 연구개발 목적 7
2. 연구개발의 필요성 8
가. 기술적 측면 8
나. 경제ㆍ산업적 측면 13
다. 사회ㆍ문화적 측면 14
3. 연구개발 범위 17
가. 1차년도(2016년) 17
나. 2차년도(2017년) 19
다. 연차별 연구개발 추진계획 20
제2장 국내외 기술 개발 현황 21
1. 국내외 기술, 산업동향 21
가. 국내 기술, 산업동향 21
나. 국외 기술, 산업동향 22
2. 국내외 특허동향 26
제3장 연구 수행 내용 및 성과 29
1. 원료 생산 연구 29
가. 미세조류 종(species) 선정 29
나. 미세조류 배양조건 확립 연구 29
다. 스피룰리나의 영양학적 성분 분석 46
라. 스피룰리나 내 Fe, Se, Zn 미네랄 함량 분석 51
마. 유기셀레늄 정량화 51
바. 요약 57
2. 원료 기능성 및 효능 평가 연구 58
가. 스피룰리나의 유용물질 분석 58
나. 스피룰리나의 항산화 효능 평가 60
다. 미세조류 함유 유기미네랄의 흡수율 평가 65
라. 실험생물의 유해물질 노출에 대한 효능 평가 76
마. 창상치유(혈관신생)에 대한 효능 연구(in vitro) 95
바. 요약 105
3. 원료 안전성 및 안정성 평가 106
가. 스피룰리나 원료 순도 분석 106
나. 스피룰리나 원료 안전성 평가 108
다. 스피룰리나 원료 안정성 평가 112
라. 요약 114
4. 시제품 개발 115
가. 배양조건 116
나. 활성물질(셀레늄) 투여 116
다. 농축 및 수확 117
라. 폐수처리 117
마. 품질검사 118
바. 건조 및 보관 120
사. 시제품 120
5. 연구개발 성과 124
가. 논문발표 성과 124
나. 특허 성과 125
다. 학회발표 성과 126
제4장 목표 달성도 및 관련 분야 기여도 127
1. 목표 달성도 127
2. 관련 분야 기여도 128
제5장 연구개발성과의 활용계획 130
1. 연구개발 성과의 활용방안 130
가. 사업화 전략 130
나. 사업화 모형(BM) 수립 130
다. 사업화 모형의 목표 131
라. 생산, 마케팅, 인력확보 등에 대한 추진전략 132
2. 기대효과 136
가. 기대성과 136
나. 파급효과 136
제6장 연구 과정에서 수집한 해외 과학기술 정보 138
제7장 연구개발성과의 보안등급 138
제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구시설ㆍ장비 현황 138
제9장 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전 조치 이행 실적 139
1. 연구실 안전조치 이행계획 139
제10장 연구개발과제의 대표적 연구 실적 141
제11장 기타 사항 142
1. 스피룰리나 영양학적 성분 분석 142
2. 미네랄(Fe, Se, Zn) 성분 분석 145
3. 안전성 및 안정성 평가 148
4. 실험동물 단회독성 평가 보고서 151
5. 스피룰리나 원료 DNA 분석보고서 152
제12장 참고문헌 153
표 1. 주요 단백질 식품의 필수아미노산 함량 10
표 2. 셀레늄의 건강 개선 효과 12
표 3. 세계의 주요 방사선사고 15
표 4. 황사 발생에 따른 전국 주요도시 중금속 농도 변화 16
표 5. GIA가 산정한 국제 해양바이오 시장 변화 추이 23
표 6. 해양바이오 세계시장 현황 및 전망 24
표 7. 해양바이오 산업 분야별 시장규모 현황 및 예측 24
표 8. 미세조류의 다양한 산업적 활용 분야와 시장 규모 25
표 9. 분석대상 특허 검색 DB 및 검색범위 26
표 10. 기능성 해양 바이오 소재의 분류 체계 26
표 11. 국내 기능성 해양 바이오 소재 특허 현황 28
표 12. 본 연구에서 사용한 modified Zarrouk's media 조성표 32
표 13. f/2 media, Enriched media 및 비료 조성표 35
표 14. 본 연구에서 분석한 성분에 따른 분석법 및 법령 근거 46
표 15. 스피룰리나 일반성분 비교 47
표 16. 스피룰리나의 아미노산 분석 48
표 17. 스피룰리나의 지방산 분석 49
표 18. 스피룰리나의 베타카로틴 분석 50
표 19. 스피룰리나 내 미네랄 농도 51
표 20. The optimized ORC ICP-MS operation conditions 53
표 21. Data acqusition parameter conditions 54
표 22. The optimized HPLC conditions for separating of Se species 55
표 23. 시간에 따른 Se 화합물의 구성비 56
표 24. 스피룰리나 시료처리에 따른 세포주기 측정 결과 98
표 25. 스피룰리나 원료의 DNA 분석 결과 107
표 26. 어댑터 시퀀스 제거 후의 스피룰리나 DNA 분석 결과 107
표 27. 마우스 대식세포주 Raw264.7을 이용한 MTT 실험 결과 109
표 28. 시험의 군 구성 및 투여용량, 투여액량 109
표 29. 스피룰리나 안정성 실험 분석항목 112
표 30. 스피룰리나의 최적 배양 조건 116
표 31. 스피룰리나 배양 시 셀레늄 투여 최적조건 116
표 32. 스피룰리나의 농축 및 수확 조건 117
표 33. 스피룰리나의 품질검사 118
표 34. 본 연구의 스피룰리나와 타사 미세조류 성분 비교(100g 당 함유량) 119
표 35. 스피룰리나의 건조 조건 120
표 37. 스피룰리나 시제품의 기준 및 규격(파우더) 121
표 38. 스피룰리나 시제품의 기준 및 규격(액상) 122
표 39. 스피룰리나의 최적 제조조건 123
그림 1. 해양 미세조류 기능성 소재 제품 사업화 개요 7
그림 2. 스피룰리나 제품의 응용 분야 7
그림 3. 연구개발의 필요성 8
그림 4. ㈜네오엔비즈에서 생산한 스피룰리나(상)와 클로렐라(하) 9
그림 5. 유럽 토양 셀레늄 분포도와 중국내 케샨, 케신백 병 분포지도 11
그림 6. 연차별 연구개발 추진계획 20
그림 7. 해양 바이오 소재 개발 현황 21
그림 8. 국내ㆍ외 기술별 점유율 27
그림 9. 연도별 전체 특허 출원 동향 27
그림 10. 본 연구에서 선정된 종(Arthrospira platensis)의 현미경 관찰 사진 29
그림 11. 스피룰리나의 다양한 배양시설 30
그림 12. 스피룰리나 배양실 30
그림 13. Lab-scale의 스피룰리나 배양 용기 31
그림 14. 200 L급 실린더 배양기(좌)와 5ton급 수조(우)에서의 배양 모습 32
그림 15. 스피룰리나의 배양기간에 따른 O.D. 값과 수율 33
그림 16. 광량에 따른 스피룰리나 생장률 34
그림 17. 광량에 따른 스피룰리나 수율 34
그림 18. 배지 종류에 따른 스피룰리나의 수율 35
그림 19. Zarrouk's 배지 혼합량에 따른 스피룰리나의 수율 36
그림 20. 해수 및 비료의 조성 성분에 따른 스피룰리나의 수율 36
그림 21. NaHCO3 농도에 따른 스피룰리나의 생장률 37
그림 22. NaHCO3 투입 시기에 따른 스피룰리나의 생장률 37
그림 23. NaHCO3 투입 시기에 따른 스피룰리나의 pH 변화 38
그림 24. 스피룰리나의 미네랄 노출 배양 실험 38
그림 25. 셀레늄 농도에 따른 스피룰리나의 생장률 39
그림 26. 셀레늄 접종시기에 따른 스피룰리나의 생장률 39
그림 27. 셀레늄 첨가에 따른 스피룰리나의 수율 40
그림 28. 스피룰리나 생산이력서(1차) 41
그림 29. 스피룰리나 생산이력서(2차) 41
그림 30. 스피룰리나 생산이력서(3차) 42
그림 31. 스피룰리나 생산이력서(4차) 42
그림 32. 스피룰리나 생산이력서(5차) 43
그림 33. 스피룰리나 생산이력서(6차) 43
그림 34. 스피룰리나 원자재검사성적서 44
그림 35. Lab-scale 배양 차수에 따른 스피룰리나 생산 건중량 45
그림 36. Pilot-scale 배양의 계절에 따른 스피룰리나 생산 건중량 45
그림 37. 스피룰리나의 아미노산 함량 비교 47
그림 38. 스피룰리나의 지방산 함량 비교 50
그림 39. 셀레늄 분석기기인 HPLC(좌)와 ICP-MS(우) 52
그림 40. 마이크로파 분해법을 이용한 시료의 전처리 과정 53
그림 41. Chromatogram of selenium standard solution mixture 55
그림 42. 스피룰리나 기능성 물질 추출 및 분석 58
그림 43. 스피룰리나 Chl a 농도 측정 59
그림 44. 미네랄 종류에 따른 스피룰리나 내 Chl a의 농도 59
그림 45. 스피룰리나 phycocyanin 농도 측정 60
그림 46. 미네랄 종류에 따른 스피룰리나 내 PC 농도 60
그림 47. 스피룰리나 내 total phenol 함량 61
그림 48. 미네랄 종류에 따른 스피룰리나 내 DPPH 라디칼 소거능 활성 62
그림 49. 스피룰리나 원산지별 광합성 색소 함량 64
그림 50. 스피룰리나 원산지별 total polyphenol과 DPPH 라디칼 소거능 64
그림 51. 스피룰리나(Arthrospira platensis) 배양 및 현미경 사진 65
그림 52. 51Cr, 59Fe, 65Zn 및 75Se의 mixture로 표지된 미세조류의 Optical Density의 변화 66
그림 53. 마우스 사육 및 배설물을 분리하여 모으기 위한 망이 설치된 사육상자 66
그림 54. 방사능 동위원소에 표지된 f/2배지에서 미세조류(Arthrospira platensis)를 배양하는 모습 67
그림 55. Feeding needle과 syringe를 이용하여 방사능 동위원소로 표지된 미세조류를 마우스에게 섭식시키는 모습과 방사능 동위원소 측정기 68
그림 56. 방사능 동위원소 측정에 사용한 감마 카운터 69
그림 57. 스피룰리나 섭식 후 48시간 동안의 유기 51Cr, 59Fe, 65Zn, 75Se과 무기 51Cr, 59Fe, 65Zn, 75Se의 마우스 체내와 배설물에서의 방사능 농도변화 70
그림 58. 마우스 체내의 방사능 농도 변화로부터 도출된 유기 및 무기물 형태의 51Cr, 59Fe, 65Zn, 75Se의 흡수효율 71
그림 59. 마우스 배설물의 방사능 농도 변화로부터 도출된 유기 및 무기물 형태의 51Cr, 59Fe, 65Zn, 75Se의 흡수효율 72
그림 60. 마우스 체내의 유기 및 무기 형태의 시간에 따른 철과 아연, 셀레늄의 제거 비율 변화 73
그림 61. 마우스 해부 모습(좌)과 해부된 마우스와 각 장기의 모습(우; 왼쪽 모서리부터 시계방향으로 심장, 콩팥, 정소, 대장 및 소장, 위, 췌장, 지라, 간) 74
그림 62. 마우스 장기내의 유기 및 무기 59Fe의 분포 비율 74
그림 63. 마우스 장기내의 유기 및 무기 65Zn의 분포 비율 75
그림 64. 마우스의 장기내의 유기 및 무기 75Se의 분포 비율 75
그림 65. 미세조류(A. platensis) 세포내에서의 유기화된 철, 아연, 셀레늄의 분포 76
그림 66. 마우스에게 섭식시킨 고형 사료에 함유된 스피룰리나(Sp) 및 유기 스피룰리나(Osp)의 함량(A, TAA(Thioacetamide) 노출 그룹; B, 중금속 노출 그룹) 77
그림 67. 스피룰리나 혹은 유기 스피룰리나가 혼합된 구형의 먹이를 마우스에게 섭식시키는 모습 77
그림 68. 스피룰리나 섭식이 중금속의 흡수, 제거 및 무독화에 미치는 영향 실험 모식도 78
그림 69. 구강 섭식용 니들을 이용하여 마우스에게 방사성 동위원소(203Hg, 109Cd, 125I)로 표지된 수용액을 섭식시키는 모습(좌)과 방사성 동위원소 측정에 사용한 감마 카운터(우) 79
그림 70. 마우스의 기관별 중금속 분포를 확인하기 위해 마우스의 간을 적출하는 모습 79
그림 71. 마우스의 기관별 세포내 중금속 분포 측정을 위한 단계별 실험 모식도 80
그림 72. 마우스 간의 SOD, GSH, Catalse 효소 분석을 위한 시료 전처리 과정 모식도 81
그림 73. 마우스의 간 조직을 분쇄기로 분쇄하고 있는 모습(좌)과 분쇄 후 원심분리기를 이용하여 상층액과 펠릿으로 분리된 모습(우) 82
그림 74. 마우스에서 적출한 간의 Catalase 효소를 분석하기 위해 형광분석 전 샘플을 시약으로 염색한 모습 82
그림 75. TAA(Thioacetamide)를 이용한 스피룰리나와 유기 스피룰리나를 섭식시킨 마우스의 간 기능 개선에 대한 실험 모식도 83
그림 76. 마우스 체내에서 중금속 흡수율 84
그림 77. 마우스의 체내 기관별 동위원소 축적 85
그림 78. 마우스의 체내 축적된 중금속의 기관별 분포도 85
그림 79. 마우스의 체내 기관별 중금속 축적 87
그림 80. 마우스의 간, 신장 그리고 그 외 조직에서 기관 별 분포 87
그림 81. 마우스의 체내에 흡수된 중금속의 잔존율 89
그림 82. 마우스의 간과 신장의 세포내 수은의 결합 형태 별 분포 90
그림 83. 마우스의 간과 신장의 세포내 카드뮴의 결합 형태 별 분포 91
그림 84. 마우스 간 조직 균질액의 SOD, GSH, Catalase 효소 분포 92
그림 85. 마우스 혈액 내 간 기능 지표 분석 결과(단기 노출 그룹) 93
그림 86. 마우스 혈액 내 간 기능 지표 분석 결과(장기 노출 그룹) 94
그림 87. 스피룰리나 시료를 IHUVEC에 24시간 처리한 MTT 결과 95
그림 88. 스피룰리나 시료를 IHUVEC에 48시간 처리한 MTT 결과 96
그림 89. 스피룰리나 시료를 HUVEC에 24시간 처리한 MTT 실험 그래프 97
그림 90. 스피룰리나 시료를 HUVEC에 48시간 처리한 MTT 실험 그래프 97
그림 91. 스피룰리나 시료처리에 따른 세포주기 변화 측정 98
그림 92. HUVEC 세포에서 미세조류 시료의 세포 성장 관련 단백질 분석 99
그림 93. HUVEC 세포에서 스피룰리나 시료의 세포 성장 관련 단백질 분석 99
그림 94. Tube formation을 이용한 혈관 형성 실험 방법 100
그림 95. HUVEC 세포에 스피룰리나를 처리하고 12시간 후 tube 형성 분석 100
그림 96. HUVEC 세포에 스피룰리나를 처리하고 24시간 후 tube 형성 분석 100
그림 97. HUVEC 세포에 스피룰리나를 처리하고 36시간 후 tube 형성 분석 100
그림 98. Wound healing을 통한 세포의 이동측정 방법 101
그림 99. IHUVEC 세포의 이동성에 대한 스피룰리나의 효과 분석 102
그림 100. HUVEC 세포의 이동성에 대한 스피룰리나의 효과 분석 102
그림 101. Human phospho RTK antibody array 배열 및 항체 리스트 103
그림 102. 스피룰리나 시료 처리 후 human phospho RTK antibody array 실험결과 104
그림 103. Illumina MiSeq® System 장비 106
그림 104. 메타지놈(Metagenome) 실험 방법 모식도 106
그림 105. 어댑터 시퀀스 처리 전 후의 total read bases 비교 107
그림 106. 어댑터 시퀀스 처리 전 후의 total reads 비교 108
그림 107. 어댑터 시퀀스 처리 전 후의 GC contents 비교 108
그림 108. 어댑터 시퀀스 처리 전 후의 Q30 비교 108
그림 109. 스피룰리나를 투여한 마우스 경구 단회독성평가 모식도 109
그림 110. 대조군 수컷 ICR 마우스의 체중 110
그림 111. 대조군 암컷 ICR 마우스의 체중 110
그림 112. 스피룰리나 Fe, Se, Zn를 투여한 마우스의 체중 변화(좌, 수컷; 우, 암컷) 111
그림 113. 스피룰리나 원료의 가속실험 결과(수분, 조섬유, 조회분, 불소) 113
그림 114. 스피룰리나 원료의 가속실험 결과(납, 카드뮴, 비소, 수은) 113
그림 115. 본 연구에서 수확한 스피룰리나의 제품화 개요 115
그림 116. 수중모터를 이용하여 수거된 스피룰리나(좌)와 5ton급 수조에서 수거중인 스피룰리나(우) 117
그림 117. 분마된 스필룰리나 원료 120
그림 118. 스피룰리나 파우더(상) 및 액상(하) 시제품 123