표제지
목차
요약문 2
Abstract 16
Ⅰ. 서론 17
1. LM 작물 개발현황 17
가. 국내동향 17
나. 국제동향 18
(1) 미국 18
(2) 브라질 19
(3) 중국 20
(4) 기타(유럽 등) 20
다. 유전자변형 작물 재배동향 21
2. 유전자변형생물체 검출법의 정의와 분류 24
3. 유전자변형생물체 검출법 개발 현황 및 목적 26
가. 단일검출법 개발현황 27
나. 동시검출법 개발현황 28
4. LMO 검출법 국제동향 30
5. 연구 목표 31
Ⅱ. 연구내용 및 방법 32
1. 단일검출법 구축 32
가. 단일검출법 대상 이벤트 선정 32
나. 유전정보 자료조사 및 표준물질 확보 32
다. 이벤트의 도입유전자 특성 33
라. 이벤트 특이적 프라이머 제작 및 검증 37
(1) 이벤트 특이적 프라이머 제작 37
(2) 프라이머 검증 39
마. 검출조건 개발 39
(1) 내재유전자 검출 조건 39
(2) 이벤트 검출 조건 39
바. 이벤트 주변염기서열 분석 40
사. 자체 검출법 개발 40
2. 동시검출법 개발 41
가. 동시검출법 대상 이벤트 선정 41
나. 유전정보 조사 및 표준물질 확보 41
다. 이벤트 특이적 프라이머 제작 및 검증 42
(1) 이벤트 특이적 프라이머 제작 42
(2) 프라이머 검증 47
라. 동시검출조건 개발 47
(1) 내재유전자 검출 확인 47
(2) 동시검출조건 개발 48
마. 동시검출법 검출한계 분석 48
바/사. 동시검출법 효율 개선 및 현장적용 48
Ⅲ. 연구결과 및 고찰 50
1. 단일검출법 개발 50
가. 표준물질로부터 genomic DNA 순수분리 50
나. 내재유전자 및 이벤트 특이적 프라이머 검증 50
(1) 콩, 면화 내재유전자 프라이머 검증 50
(2) 이벤트 특이적 LM 유전자 검증 52
다. 기존 단일검출법 확인 및 자체검출법 개발 52
(1) LM콩 이벤트(2종; MON87751, SYHT0H2) 기존 검출법 확인 52
(가) MON87751 검출조건 및 결과 52
(나) SYHT0H2 검출조건 및 결과 53
(2) LM면화(3종; MON88701, T304-40, DAS-81910-7) 이벤트에 대한 기존 검출법 확인 및 자체검출법 확인 53
(가) MON88701 검출조건 및 결과 54
(나) T304-40 검출조건 및 결과 54
(다) DAS-81910-7 검출조건 및 결과 55
(3) LM옥수수(2종; MON87419, DP-004114-3) 이벤트에 대한 검출법 개발 56
(가) MON87419 검출조건 및 결과 56
(나) DP-004114-3 검출조건 및 결과 56
라. 주변염기서열 분석 57
마. 자체 검출법 개발 58
2. 동시검출법 개발 67
가. 표준물질로부터 genomic DNA 순수분리 67
나. 제작한 프라이머 검증(내재유전자/LM 특이유전자 증폭) 68
(1) 콩, 면화에 대한 내재유전자 검증 68
(2) 이벤트 특이적 LM 유전자 검증 70
다. 동시검출법(Multiplex) 프라이머 선정 및 최적 동시검출법 개발 73
(1) 콩 동시검출법 개발 73
(2) 면화 동시검출법 개발 74
라. 개발된 동시검출법의 검출한계 분석 75
(1) 콩 동시검출법의 검출한계 분석 76
(2) 면화 동시검출법의 검출한계 분석 77
마. 동시검출법 무작위 검출 검증 77
바. 동시검출법 효율 개선 및 현장적용 79
(1) 면화 동시검출법 효율 개선 및 현장적용 사례 79
(2) 콩 동시검출법 현장적용 사례 82
Ⅳ. 결론 및 향후계획 85
1. 단일검출법 85
2. 동시검출법 86
3. 동시검출법 효율 개선 87
4. 검출법 활용 87
5. 검출율 제고 방안 88
6. 국제공인인정기관 추진 88
Ⅴ. 참고문헌 89
[부록] 93
표 1. 국내 산업용 LM 작물 개발연구(KBCH 바이오안전성백서 2017) 17
표 2. LM 작물 개발 흐름(KBCH, 2017) 18
표 3. 미국 농무부의 genome editing 작물 10개에 대한 판정(KBCH, 2017) 19
표 4. 유전자변형 작물 국가별 재배면적 22
표 5. 4대 작물 재배면적 현황(ISAAA, 2017) 23
표 6. 환경부/국립생태원 단일검출법 개발 현황 28
표 7. 환경부/국립생태원 동시검출법 개발 현황 30
표 8. 단일검출대상 LM 표준물질 33
표 9. 검출법 대상 이벤트의 유전정보 및 수입승인 현황 34
표 10. 단일검출법 개발을 위한 JRC 및 자체개발 프라이머 염기서열 38
표 11. 단일검출법 PCR 반응액 조성 39
표 12. 동시검출법 개발 이벤트 현황 42
표 13. 콩 동시검출용 프라이머 정보 45
표 14. 면화 동시검출용 프라이머 정보 46
표 15. 동시검출법 PCR 반응액 조성 47
표 16. 작물별 내재유전자의 생성물 정보 51
표 17. 7개 LMO 이벤트의 PCR 최종산물 염기서열 분석 58
표 18. 검출한계(LOD)농도 검증을 위한 genomic DNA 희석 농도 76
표 19. 개선된 면화 동시검출법 primer 염기서열 정보 81
그림 1. 유전자변형 작물 재배면적 현황(미국, 브라질, 아르헨티나, 캐나다, 인도, 중국; Clive, 2017) 21
그림 2. 연도별 유전자변형생물체 수입량(KBCH, 수입 및 수출현황) 23
그림 3. Articles of the Cartagena Protocol on Biosafety whose implementation is influenced by parties' ability to detect and indentify LMOs 24
그림 4. 단백질 기반 및 유전자 기반 LMO 검출법의 검출원리 25
그림 5. 연도별 단일검출법 개발 현황(2011~2017) 28
그림 6. 연도별 동시검출법 개발 현황(2013~2017) 29
그림 7. 단일검출법 개발 대상 7개 LM 표준물질. 왼쪽부터 MON87751, SYHT0H2, DAS-81910-7, MON87419, MON88701, T304-40, DP-004114-3 33
그림 8. 4개 LM 이벤트의 도입유전자 특성 및 모식도. (A) MON87751 이벤트 삽입유전자 모식도, (B) SYHT0H2 이벤트 삽입모식도, (C) MON88701 이벤트 삽입유전자 모식도,... 37
그림 9. PCR 반응 조건 40
그림 10. 동시검출법 개발 대상 LM 이벤트 표준물질. 왼쪽부터 DAS-81419-2, MON87751, SYHT0H2, DAS-81910-7, MON88701, COT102, T304-40 42
그림 11. 7개 LMO 이벤트의 도입유전자 구성정보 및 프라이머 위치. (A) MON87751; (B) SYHT0H2; (C) DAS-81419-2; (D) MON88701; (E) T304-40; (F) COT102; (G) DAS-81910-7... 43
그림 12. 정제한 genomic DNA 전기영동. Lane 1: non-LM 콩, lane 2: MON87751(콩), lane 3: SYHT0H2(콩), lane 4: non-LM 면화, lane 5: MON88701(면화), lane 6: T304-40(면화),... 50
그림 13. Non-LM 및 각 이벤트별 내재유전자 검출 PCR 결과. Lane 1: non-LM 콩, lane 2: MON87751(콩), lane 3: SYHT0H2(콩), lane 4: non-LM 면화, lane 5: MON88701(면화),... 51
그림 14. MON87751 이벤트 단일검출법 확인. Lane 1: non-LM, lane 2: MON87751. M: 100 bp Marker 52
그림 15. SYHT0H2 이벤트 단일검출법 확인. Lane 1: non-LM, lane 2: SYHT0H2. M: 100 bp Marker 53
그림 16. MON88701 이벤트 단일검출법 확인. Lane 1: non-LM, lane 2: MON88701. M: 100 bp Marker 54
그림 17. T304-40 이벤트 단일검출법 확인. Lane 1: non-LM, lane 2: T304-40. M: 100 bp Marker 55
그림 18. DAS-81910-7 이벤트 단일검출법 확인. Lane 1: non-LM, lane 2: DAS-81910-7. M: 100 bp Marker 55
그림 19. MON87419 이벤트 단일검출법 확인. Lane 1: non-LM, lane 2: MON87419, M: 100 bp Marker 56
그림 20. DP-004114-3 이벤트 단일검출법 확인. Lane 1: non-LM, lane 2: DP-004114-3, M: 100 bp Marker 57
그림 21. LM 콩(MON87751, SYHT0H2) 신규 프라이머 모식도. (A) MON87751 이벤트의 신규 프라이머, (B) SYHT0H2 이벤트의 신규 프라이머 59
그림 22. LM 면화(MON88701, T304-40, DAS-81910-7) 신규 프라이머 모식도. (A) MON88701 이벤트의 신규 프라이머, (B) T304-40 이벤트의 신규 프라이머, (C) DAS-81910-7 이벤트의... 60
그림 23. LM 옥수수(MON87419, DP-004114-3) 신규 프라이머 모식도. (A) MON87419 이벤트의 신규 프라이머, (B) DP-004114-3 이벤트의 신규 프라이머 61
그림 24. 신규 프라이머를 이용한 MON87751 이벤트 검출확인. Lane 1, 7: 콩 내재유전자 Le1 F + Le1 R(211 bp), lane: 2, 8: JRC 프라이머 MON8851R-JV1 + MON87751R-JP1(87 bp),... 62
그림 25. 신규 프라이머를 이용한 SYHT0H2 이벤트 검출확인. (A) 신규 프라이머와 JRC 프라이머 조합 검증 결과 Lane 1: 콩 내재유전자 Le1 F + Le1 R(221 bp), lane 2: JRC 프라이머... 63
그림 26. 신규 프라이머를 이용한 MON88701 이벤트 검출확인. Lane 1: 면화 내재유전자 AdhC F + AdhC R(178 bp), lane 2: JRC 프라이머 MON88701R-JV1 + MON88701R-JP1(84 bp),... 64
그림 27. 신규 프라이머를 이용한 T304-40 이벤트 검출확인. Lane 1: 면화 내재유전자 AdhC F + AdhC R(178 bp), lane 2: JRC 프라이머 T301-40L-JV1 + T301-40L-JP1(78 bp),... 65
그림 28. 신규 프라이머를 이용한 DAS-8190-7 이벤트 검출확인. Lane 1: 면화 내재유전자 AdhC F + AdhC R(178 bp), lane 2: DAS-81910-7L-V1 + DAS-81910-7L-P1(114 bp),... 65
그림 29. 신규 프라이머를 이용한 MON87419 이벤트 검출확인. Lane 1: 옥수수 내재유전자 Adh1 F + Adh1 R(179 bp), lane 2: MON87419L-V1 + MON87419L-P1(106 bp), lane 3: MON87419L-V1... 66
그림 30. 신규 프라이머를 이용한 DP-004114-3 이벤트 검출확인. Lane 1: 옥수수 내재유전자 Adh1 F + Adh1 R(179 bp), lane 2: DP-004114-3L-V1 + DP-004114-3L-P1(119 bp), lane 3:... 66
그림 31. 동시검출법 대상 이벤트의 genomic DNA 전기영동 결과. (A) 콩 동시 검출법 대상 이벤트. Lane1: non-LM 콩 lane 2: MON87751, lane 3: SYHT0H2, lane 4: DAS-81419-2... 68
그림 32. 표준물질을 이용한 내재유전자 및 이벤트 특이적 LM유전자 증폭. (A) LM 콩 DAS-81419-2의 내재유전자 및 LM 유전자 확인. Lane 1, 3: non-LM 콩, lane 2, 4: DAS-81419-2... 69
그림 33. DAS-81419-2(콩) 이벤트의 특이 유전자 증폭 검증(국립생태원 2017b). (A) 식물체 유전자을 바탕으로 디자인한 프라이머 검증 결과 (B) 삽입 유전자를 바탕으로 디자인한... 71
그림 34. COT102(면화) 이벤트의 특이 유전자 증폭 검증. (A)기 개발된COT102 이벤트 특이 검출법(국립생태원, 2017b) (B), (C) 신규 제작한 프라이머 조합. (A) Lane 1: COT102 F... 72
그림 35. LM 콩 3개 이벤트 동시검출법 개발. Lane 1: DNA Mix + MON87751R-JV1 + MON87751R-P1(221 bp), lane 2: DNA Mix + DAS-81419-2JV1 + DAS-81419-2L-P4(300 bp), lane 3: DNA Mix... 74
그림 36. LM 면화 4개 이벤트 동시검출법 개발. Lane 1: DNA Mix + COT102R-V5 + COT102R-P2(108 bp), lane 2: DNA Mix + T304-40L-JV1 + T304-40L-P2(157bp), lane 3: DNA Mix + MON88701R-JV1... 75
그림 37. LM 콩 동시검출법 검출한계 분석 결과 76
그림 38. LM 면화 동시검출법 검출한계 분석 결과 77
그림 39. LM 콩 무작위 검증 분석 결과. Lane 1: non-LM, lane 2: MON87751, lane 3: DAS-81419-2, lane 4: SYHT0H2, lane 5: MON87751 + DAS-81419-2, lane 6: MON87751 + SYHT0H2, lane 7... 78
그림 40. LM 면화 무작위 검증 분석 결과. Lane 1: non-LM, lane 2: COT102, lane 3: T304-40, lane 4: MON88701, lane 5: DAS-81910-7, lane 6: COT102 + T304-40, lane 7: COT102 + MON88701,... 78
그림 41. 기 개발된 LM 면화 검출법. Lane 1: non LM Cotton, lane 2: MON88913(164 bp), lane 3: MON15985(214 bp), lane 4: LLCOTTON25(276 bp), lane 5: MON1445(389 bp), lane 6: 281-3006(518 bp),... 80
그림 42. 국내 유전자변형생물체 자연환경 모니터링 LM 의심시료 분석결과. (A) 면화 내재유전자(acp1)를 이용한 면화검증, (B) 동시검출법을 이용한 유전자 변형생물체 자연환경... 82
그림 43. LM 콩 동시검출법의 현장적용을 위한 무작위 조합 시료 검출검증(Choi et al., 2018) 83
그림 44. 콩 동시검출법 현장적용 및 2017년 모니터링 시료분석 결과(Choi et al., 2018). (A) 시료채집위치. (B) 모니터링 결과 발견된 LM 의심 개체(콩). (C) 동시검출법 적용결과 84