표제지
목차
요약문 2
Abstract 22
I. 서론 23
1. 해충저항성 LMO 위해성평가의 중요성 23
2. LMO에 대한 환경위해성평가 및 체계 25
3. 해충저항성 LMO에 대한 국내 환경위해성평가 28
4. 분해자군, 포식자군에 대한 위해성평가 대상종 지정 및 평가 방법 마련의 중요성 36
5. 국내 실정에 맞는 LMO 심사 항목 마련 필요성 40
6. 해충저항성 LMO 이용한 국내 자연환경 위해성평가의 필요성 41
7. 해충저항성 LMO 제작 방법 마련 및 구축 필요성 43
II. 연구내용 및 방법 45
1. 국내 LMO 위해성평가 생물종 선정 45
2. 포식자군에 대한 위해성평가 방법 46
가. H. axyridis(무당벌레) 위해성평가 방법 46
나. N. tenuis(담배장님노린재) 위해성평가 방법 47
3. 분해자군 위해성평가 방법 48
가. E. fetida (줄지렁이) 위해성평가 방법 48
4. 해충저항성 LMO 발현산물에 관한 위해성평가서 작성 48
5. 해충저항성 LMO 유전자 확보 및 발현산물 특성 분석 50
가. LMO 작물 제작용 플라스미드 구축 50
나. LM 모델식물 제작 및 발현산물 특성 분석 50
III. 연구결과 및 고찰 52
1. 포식자군 위해성평가 52
가. H. axyridis 위해성평가 기법 개발 및 평가 52
나. N. tenuis 위해성평가 기법 개발 및 평가 53
2. 토양생물 위해성평가 54
가. E. fetida 위해성평가 기법 개발 및 평가 54
3. 해충저항성 LMO 발현산물에 관한 위해성평가서 작성 58
가. 해충저항성 LMO 발현산물 평가 자료(통합고시 별표10-1) 59
(1) Chapter 2. 숙주생물체에 관한 자료의 작성 59
(2) Chapter 3. 공여체에 관한 자료의 작성 62
(3) Chapter 5. 도입유전자에 관한 자료의 작성 63
(4) Chapter 6. 유전자변형생물체의 개발에 관한 자료의 작성 67
(5) Chapter 7. 유전자변형생물체 특성에 관한 자료의 작성 71
(6) Chapter 9. 세부 위해 영향 자료의 작성 77
4. 해충저항성 LMO 유전자 확보 및 발현산물 특성 분석 92
가. 해충저항성 LMO 유전자 확보 92
나. 해충저항성 LM 모델식물 내 발현산물 특성 분석 94
IV. 결론 및 제언 99
참고문헌 103
[부록 1] 연구성과 및 활용 110
표 1. LM 작물 위해성평가를 위한 Tier system 평가항목 및 고려사항 27
표 2. 국내에서 이루어진 해충저항성 LMO의 비표적 생물체에 미치는 영향 평가 연구 28
표 3. 해충저항성 LMO의 비표적 생물종에 대한 환경위해성 평가자료 요약 30
표 4. 해충저항성 LMO의 위해성평가 생물종 선정을 위한 평가항목 및 고려사항 33
표 5. Vip3Aa 단백질 위해성평가 국내 생물종 선정 34
표 6. Vip3Aa 단백질 위해성평가 국내 토양미생물 선정 35
표 7. 해충저항성 LMO 발현산물에 대한 위해성평가서 작성 항목 49
표 8. H. axyridis의 Vip3Aa 단백질에 대한 생존분석결과(Log-Rank test) 53
표 9. N. tenuis의 Vip3Aa 단백질에 대한 생존분석결과(Log-Rank test) 54
표 10. E. fetida에 대한 Vip3Aa 단백질 처리 방법 55
표 11. E. fetida 몸무게 변화 57
표 12. 해충저항성 모델식물 구축을 위한 플라스미드 제작 68
표 13. Vip3Aa 단백질 동등성 확인을 위한 분석 방법 75
표 14. P. interpunctella의 Vip3Aa 단백질에 대한 생존분석 결과(Log-Rank test) 79
표 15. O. furnacalis의 처리군 별 생존분석 결과(Log-Rank test) 80
표 16. S. montela의 처리군 별 생존분석 결과(Log-Rank test) 81
표 17. H. axyridis의 Vip3Aa 단백질에 대한 생존분석결과(Log-Rank test) 84
표 18. N. tenuis의 Vip3Aa 단백질에 대한 생존분석결과(Log-Rank test) 85
표 19. E. fetida 몸무게 변화 86
그림 1. 연도별 국내 식품ㆍ사료용 LMO 수입현황(한국바이오안전성정보센터(Korea Biosafey Clearing House; KBCH)) 23
그림 2. 국내 수입 LMO 유출 사례 중 해충저항성 LMO 유출 비율(국립생태원, 2017) 24
그림 3. 국내 수입 승인 해충저항성 Vip3Aa LM 작물 현황(KBCH) 25
그림 4. LMO 환경위해성평가 시스템(Tier system) 26
그림 5. LMO 환경위해성평가를 위한 국내 대상 생물종 선정 기준 32
그림 6. 포식자군과 분해자군이 해충저항성 LMO에 노출되는 경로 37
그림 7. 해충저항성 LMO에 노출 가능한 분해자군과 포식자군 38
그림 8. 포식자군에 대한 위해성 시나리오 39
그림 9. 별늑대거미를 적용한 해충저항성 LMO의 위해성평가 39
그림 10. 모델식물을 이용한 LMO 구축 방법 42
그림 11. 먹이그물 기반 LMO 자연생태계 위해성평가 대상종 선정 45
그림 12. H. axyridis를 이용한 위해성평가 방법 46
그림 13. N. tenuis를 이용한 위해성평가 방법 47
그림 14. E. fetida를 이용한 위해성평가 방법 48
그림 15. LM 작물 제작용 플라스미드 구축 방법 50
그림 16. LM 모델식물 제작 모식도 및 방법 51
그림 17. H. axyridis 생존 곡선(검정색 점: 무처리구, 노란색 점: Hepes buffuer, 붉은색 점: Vip3Aa 단백질) 52
그림 18. N. tenuis 생존 곡선(검정색 점: 무처리구, 노란색 점: Hepes buffuer, 붉은색 점: Vip3Aa 단백질) 54
그림 19. E. fetida 위해성평가 (A) 생존개체수, (B) 이상행동 개체 56
그림 20. Vip3Aa 단백질 도메인 모식도 및 아미노산 정보 (A) Vip3Aa 단백질 도메인 모식도, (B) Vip3Aa 아미노산 서열 63
그림 21. 대장균을 이용한 Vip3Aa 단백질 순수분리 프로토콜 64
그림 22. Vip3Aa 단백질 순수도 및 동질성 확인 (A) 순수분리한 Vip3Aa 단백질 SDS-PAGE 전기영동, (B) Vip3Aa 단백질 MALDA-TOP peptide 분석, (C) Vip3Aa peptide 아미노산 서열분석 65
그림 23. Vip3Aa 단백질 분자량 및 특성 분석 (A) Vip3Aa 단백질 Ntive-PAGE 전기영동, (B) Vip3Aa 단백질 FPLC 분석, (C) Vip3Aa 단백질 FPLC fraction SDS-PAGE 전기영동, (D) Vip3Aa 단백질... 66
그림 24. Vip3Aa 단백질 안정성 분석 (A) 잔류기간에 따른 안정성, (B) 온도변화에 따른 안정성 (C) pH변화에 따른 안정성 67
그림 25. 해충저항성 모델식물 구축 프로토콜 68
그림 26. 해충저항성 모델식물 구축을 위한 PCR 실험 (A) PCR 조건, (B) 전기영동 결과 69
그림 27. 해충저항성 모델식물용 플라스미드 제작 및 형질 전환 Agrobacterium cell 선별 (A) Vip3Aa 형질전환 플라스미드 구축을 위한 vector 및 유전자 확인 (B) PCR 방법을 통한 형질전환... 69
그림 28. Agrobacterium법 이용한 Vip3Aa 유전자 식물 도입 방법 70
그림 29. 형질전환 모델식물 구축 프로토콜 71
그림 30. P. interpunctella의 생존곡선(검정색 점: 무처리구, 노란색 점: Hepes buffuer, 붉은색 점: Vip3Aa 단백질) 79
그림 31. O. furnacalis의 처리군 별 생존곡선 80
그림 32. S. montela의 처리군 별 생존곡선 81
그림 33. A. melifera에 대한 위해성평가 (A) 생존개체수, (B) 일반중독 개체수 82
그림 34. D. magna에 대한 위해성평가 (A) 생존개체수, (B) 일반중독 개체수 83
그림 35. H. axyridis 생존 곡선(검정색 점: 무처리구, 노란색 점: Hepes buffuer, 붉은색 점: Vip3Aa 단백질) 84
그림 36. N. tenuis 생존 곡선(검정색 점: 무처리구, 노란색 점: Hepes buffuer, 붉은색 점: Vip3Aa 단백질) 85
그림 37. E. fetida 위해성평가 (A) 생존개체수, (B) 일반중독증상 86
그림 38. 토양 곰팡이 위해성평가 (A) 선정된 국내 토양 곰팡이, (B) 곰팡이 위해성평가 결과 88
그림 39. 토양 박테리아 위해성평가 (A) 선정된 국내 토양 박테리아, (B) 박테리아 위해성평가 결과 89
그림 40. 토양 미생물 위해성 매커니즘 (A) 매커니즘 분석방법, (B) 매커니즘 분석결과 90
그림 41. pCKLSL-35Sp vector에 대한 정보(제한효소 및 구조확인) 93
그림 42. Vip3Aa 유전자의 과발현 vector 클로닝 (A) Vip3Aa 제한효소 삽입을 위한 PCR, (B) Vip3Aa 유전자 pCKLSL-35Sp vector에 삽입 확인 94
그림 43. Vip3Aa 유전자 도입 Agrobacterium cell 선별(PCR 분석법) 94
그림 44. Vip3Aa 유전자의 T-blunt vector 내 cloning (A) Vip3Aa PCR product, (B) 제한효소 처리 후 Vip3Aa 유전자 확인 95
그림 45. 형질전환 모델식물용 플라스미드 구축 (A) pCAMBIA vector에 대한 정보(제한효소 및 구조확인), (B) Vip3Aa 플라스미드 클로닝 96
그림 46. 형질전환 Agrobacterium cell 선별 96
그림 47. Vip3Aa 유전자 도입 식물 선별 및 mRNA level 분석. 선별된 4번 식물(그림 43)의 다음세대 Vip3Aa mRNA level 분석 98
그림 48. Vip3Aa LM 식물 선별 및 발현산물 특성 분석(ELISA 분석법) (A) Vip3Aa 유전자 도입 A. thaliana 선별, (B) ELISA 실험 원리, (C) ELISA 분석 프로토콜, (D) Vip3Aa 발현 분석 결과 98