표제지
목차
요약문 2
Abstract 19
Ⅰ. 서론 20
1. 유전자 기반의 유전자변형생물체 개요 20
2. 최근 연구개발 동향 21
가. 국내동향 21
나. 해외동향 22
3. RNAi LMO 위해성평가 체계 23
가. RNAi 작물 개발 현황 23
나. RNAi 기술의 적용 다양성 24
(1) 작물 품질 특성 향상 24
(2) 바이러스 저항성 24
(3) 해충 저항성 25
(4) 선충 저항성 25
(5) 세균과 곰팡이 저항성 26
다. 생태계 위해성평가의 함의 32
라. 비표적생물체 위해 경로 34
4. 토양생태계 생물체에 대한 RNAi 기술의 위해성 36
가. Nematodes 37
(1) 국제표준의 시험 원칙 37
나. Collembola 38
(1) Collembola 생식률 시험(OECD 232, adopted 2009) 39
(가) 서론 39
(나) 시험의 원칙 40
(다) 시험물질 정보 40
(라) 시험의 유효성 41
(마) 표준물질 41
(바) 세부 시험 방법 41
다. Earthworm 44
(1) 서론 44
(2) 시험의 원칙 45
라. 토양미생물 47
5. 위해성평가를 위한 작물 개발 48
가. 위해성평가의 제한요인 48
(1) 도입유전자의 삽입위치 및 유전적 안전성 여부 49
(2) 도입유전자 및 운반체에 관한 정보 49
(3) 품종 순도관리 50
나. 위해성평가를 위한 LM 작물 개발 51
6. 위해성평가 가이던스 사례 연구 52
가. 국내 생물종 위해성평가 가이던스 52
나. ISO 가이던스 54
다. OECD 가이던스 56
라. LMO 위해성평가 및 위해관리 국제 동향 56
7. 연구목표 및 필요성 57
가. 연구목표 57
나. 연구필요성 57
(1) 정책적 필요성 57
(2) 사회/경제적 필요성 57
(3) 기술적 필요성 58
Ⅱ. 연구내용 및 방법 59
1. dsRNA 순수분리 59
가. dsRNA 발현 및 분리정제 방법 59
(1) dsRNA 대량 발현 59
(2) dsRNA의 효율적인 정제 조건 확립 60
2. 위해성평가 대상종의 특성 및 실험방법 61
가. C. elegans 61
(1) 생존 및 생식 조사(Xiong et al., 2017) 61
나. Collembola 62
(1) P. kimi 사육 및 실험방법 64
(가) 챠콜-석고배지 제조 64
(나) 인공토양 제조 64
(다) 챠콜-석고배지 배양 66
(라) 일반생육조건 66
(마) 산란 66
(바) 급성독성평가(Range finding) 67
다. E. fetida 68
(1) 사육환경 68
(2) 노출조건 69
(3) 치사 및 이상증상 관찰 69
(4) E. fetida의 체중 조사 69
(5) 인공토양의 pH 및 수분함량 조사 69
(6) 시험물질 처리 69
라. 토양미생물 71
(1) 토양곰팡이 대상종 선정 71
(2) 토양곰팡이 실험방법 71
(3) 토양박테리아 대상종 선정 74
(4) 토양박테리아 실험방법 74
3. 형질전환 식물체 선발 실험방법 77
가. 형질전환 유전자 확보 및 클로닝 77
(1) 식물형질전환 77
(가) A. thaliana 형질전환 77
(나) N. tabacum 형질전환 78
Ⅲ. 연구결과 및 고찰 80
1. dsRNA의 순수분리 80
가. dsRNA의 효율적인 정제 80
2. 위해성평가 결과 82
가. C. elegans 위해성평가 결과 82
(1) C. elegans 대량 사육 82
(2) C. elegans의 생존 및 생식 조사 82
(3) C. elegans 중금속 노출시험 83
(가) 붕산(Boric acid) 84
(나) 구리(Copper) 89
(다) 망간(Manganese) 93
(라) 아연(Zinc) 97
(4) C. elegans dsRNA 노출시험 101
나. P. kimi 위해성평가 결과 108
(1) P. kimi 대량 사육 108
(2) P. kimi 단기독성평가 결과 109
(3) P. kimi 무영향농도 110
다. E. fetida 위해성평가 결과 110
(1) 일반중독증상 및 치사 111
(2) 체중변화 114
(3) 인공토양의 pH 및 수분합량 115
(4) 조도 및 온도 117
라. 토양미생물 위해성평가 결과 118
(1) 토양곰팡이 위해성평가 결과 118
(2) 토양박테리아 위해성평가 결과 122
3. 형질전환체 선별 결과 125
가. A. thaliana 형질전환 결과 125
나. N. tabacum 형질전환 결과 126
Ⅳ. 결론 130
참고문헌 131
[부록 1] 연구성과 및 활용 140
표 1. 국내 LMO 수입승인 현황(KBCH, 2018년 9월 기준) 21
표 2. RNAi 기반 병해충 저항성 작물개발 현황(Satyajit et al. 2014) 27
표 3. RNAi 기반 유용유전자발현 식물체 개발현황(Satyajit et al. 2014) 28
표 4. RNA 기반 LMO 작물 개발 현황(Auer et al. 2009) 30
표 5. 토양생태계 위해성평가 관련 보고서 36
표 6. C. elegans 국제공인 시험법(안윤주. 2014) 38
표 7. 화학물질 3종의 F. fimetaria와 F. candida 평균 LC50과 EC50값 44
표 8. 지렁이 국제공인 시험법(안윤주. 2014) 46
표 9. 화학물질의 환경에 관한 유해성확인 항목 52
표 10. 종민감도분포 이용을 위한 최소자료 요건 53
표 11. 환경생물에 미치는 영향 검토시 단계별 시험내용 54
표 12. ISO에서 제공하는 지침서 목록 55
표 13. 중금속 치사 농도(Chu et al., 2002) 62
표 14. 위해성평가의 영향종말점 및 독성종말점 63
표 15. Collembola류의 국제 공인 시험법 63
표 16. 시험물질 처리 70
표 17. 국내 토양 내 곰팡이 종류 72
표 18. 토양곰팡이 위해성평가 대상종 선정 73
표 19. 국내 토양 내 박테리아 종류 75
표 20. 토양 박테리아 위해성평가 대상종 선정 76
표 21. 붕산(Boric acid) 처리에 따른 일자별, 농도별 C. elegans 생장률 88
표 22. 구리(Copper) 처리에 따른 일자별, 농도별 C. elegans 생장률 92
표 23. 망간(Manganese) 처리에 따른 일자별, 농도별 C. elegans 생장률 96
표 24. 아연(Zinc) 처리에 따른 일자별, 농도별 C. elegans 생장률 100
표 25. GFP dsRNA 처리에 따른 일자별, 농도별 C. elegans 생장률 107
표 26. DvSnf7 dsRNA 처리에 따른 일자별, 농도별 C. elegans 생장률 107
표 27. E. fetida 누적 치사율 112
표 28. E. fetida의 이상반응 113
표 29. 시험기간 동안의 체중변화 114
표 30. pH의 변화 115
표 31. 수분의 변화 116
표 32. 배양기의 빛 강도 117
표 33. 시험기간 중 배양기의 온도변화 117
표 34. 토양곰팡이 최소성장저해농도 118
표 35. 토양박테리아 최소성장저해농도 122
그림 1. LMO 이벤트 개발 현황(1996~2016) 20
그림 2. 위해성평가체계 모식도(Roberts et al., 2015) 35
그림 3. 세균, 고세균, 진행생물의 SSU rRNA 유전자 계통도 47
그림 4. 토양 pH 보정을 위한 CaCO₃ 첨가량 측정 곡선. 인공토양 pH 6.0 보정을 위하여 CaCO₃ 0.058g/soil 10g을 첨가 65
그림 5. dsRNA 발현 플라스미드 모식도. 위부터 pCAMBIA1300, pK7GWIW(2), pHellsgate12 클로닝 모식도 77
그림 6. N. tabacum 형질전환 과정 (A) 영양배지내 N. tabacum 종자 발아, (B) pre-culture 배지내 잎 조직 배양, (C) N. tabacum 잎 절편과 Agrobacterium의 공동배양, (D) 세척 및 선택배지내 배양 78
그림 7. dsRNA의 효율적인 정제. (A)는 기존 방법으로 추출된 dsRNA (B)는 효율적인 정제 방법으로 추출된 dsRNA 80
그림 8. dsRNA 추출과정 개략도. (A) 기존 dsRNA 추출과정 (B) 효율적인 dsRNA 추출과정 81
그림 9. C. elegans 대량 배양 중 성장단계 관찰 (A) C. elegans L1 단계 군집 (B) C. elegans L2 단계 군집 (C) C. elegans L3 단계 82
그림 10. C. elegnas의 생존 및 생식 조사 방법 83
그림 11. C. elegnas의 생존 및 생식 조사 예비실험 결과. 참고논문(Xiong et al., 2017)의 실험을 재연, 같은 결과를 얻음 83
그림 12. 붕산(Boric acid) 처리 C. elegans 위해성평가 단기 테스트 85
그림 13. 붕산(Boric acid) 처리 C. elegans 위해성평가 장기 테스트 86
그림 14. 붕산(Boric acid) 처리 C. elegans 위해성평가 확대 이미지 87
그림 15. 구리(Copper) 처리 C. elegans 위해성평가 단기 테스트 89
그림 16. 구리(Copper) 처리 C. elegans 위해성평가 장기 테스트 90
그림 17. 구리(Copper) 처리 C. elegans 위해성평가 확대 이미지 91
그림 18. 망간(Manganese) 처리 C. elegans 위해성평가 단기 테스트 93
그림 19. 망간(Manganese) 처리 C. elegans 위해성평가 장기 테스트 94
그림 20. 망간(Manganese) 처리 C. elegans 위해성평가 확대 이미지 95
그림 21. 아연(Zinc) 처리 C. elegans 위해성평가 단기 테스트 97
그림 22. 아연(Zinc) 처리 C. elegans 위해성평가 장기 테스트 98
그림 23. 아연(Zinc) 처리 C. elegans 위해성평가 확대 이미지 99
그림 24. GFP dsRNA 처리 C. elegans 위해성평가 단기 테스트 101
그림 25. DvSnf7 dsRNA 처리 C. elegans 위해성평가 단기 테스트 102
그림 26. GFP dsRNA 처리 C. elegans 위해성평가 장기 테스트 103
그림 27. DvSnf7 dsRNA 처리 C. elegans 위해성평가 장기 테스트 104
그림 28. GFP dsRNA 처리 C. elegans 위해성평가 확대 이미지 105
그림 29. DvSnf7 dsRNA 처리 C. elegans 위해성평가 확대 이미지 106
그림 30. P. kimi 산란 및 부화. (A) 산란중인 P. kimi, (B) 알 수집, (C) 부화중인 개체(산란 후 5일 경과), (D) 부화중인 P. kimi 개체(산란 후 8일 경과) 108
그림 31. P. kimi에 대한 dsRNA의 단기독성평가 결과 109
그림 32. E. fetida 사육 사진 (A) 시험시작직후 (B) 28일 경과 후 111
그림 33. dsRNA에 대한 토양곰팡이 위해성 평가 1 119
그림 34. dsRNA에 대한 토양곰팡이 위해성 평가 2 120
그림 35. dsRNA에 대한 토양곰팡이 위해성 평가 3 121
그림 36. dsRNA에 대한 토양박테리아 위해성 평가 1 123
그림 37. dsRNA에 대한 토양박테리아 위해성 평가 2 124
그림 38. 형질전환 A. thaliana 선별 과정 (A) 항생제 배지 선발 생존 개체 없음. (B) 항생제 배지 선발 개체 있음 (C) 항생제 배지 선발을 마치고 생존 개체를 옮겨 심은 포트 125
그림 39. 형질전환 N. tabacum 선별 과정 126
그림 40. N. tabacum 형질전환체 배양 127
그림 41. GFP dsRNA가 형질전환된 N. tabacum 예 128
그림 42. DvSnf7 dsRNA가 형질전환된 N. tabacum 예 129