표제지
목차
요약문 2
Abstract 21
Ⅰ. 서론 23
1. 유전자변형작물 재배 현황 23
가. 형질별 LMO 재배 현황 25
나. 최근 연구개발 동향 26
2. RNAi기반 유전자변형생물체 개발 현황 27
3. 위해성 평가 27
4. 비표적 생물체에 대한 RNAi 기술의 위해성 28
가. Off target 유전자의 silencing 29
나. 비표적 생물체의 유전자 억제 29
다. 면역체계 자극 30
라. RNAi 생산 체계(machinery) 30
5. 연구목표 및 필요성 30
Ⅱ. 연구내용 및 방법 32
1. Total RNA에서 순수 dsRNA 분리 32
가. dsRNA 발현 및 분리정제 방법 32
(1) dsRNA 대량 발현 32
(2) dsRNA 순수분리 방법 32
(3) dsRNA의 농도와 반응 부피증가에 따른 정제 조건 확립 33
나. 상온에서 dsRNA의 안전성확인 방법 34
2. 담배의 일시적 발현 연구내용 및 연구방법 34
가. Agrobacterium을 이용한 식물세포내 발현시스템 구축 34
(1) 일시발현 시스템 구축을 위한 클로닝 방법 34
(2) 일시적 발현을 위한 직접주입법(infiltration) 35
나. dsRNA 발현량 확인을 위한 Q-PCR 36
(1) 일시발현한 담배에서 total RNA분리 36
(2) dsRNA 발현 확인을 위한 상보성 DNA 합성 37
(3) 정량 PCR 실험 방법(Quantitative Realtime PCR) 38
3. dsRNA의 확인을 위한 Northern Blot 연구내용 및 연구방법 39
가. Northern blot을 위한 Snf7의 biotin과 DIG 표지 39
나. Biotin이 표지된 Snf7의 Northern Blot수행 방법 41
다. DIG가 표지된 Snf7의 Northern Blot수행 방법 42
4. 위해성 평가 대상종 선정의 연구내용 및 연구방법 43
5. 위해성평가 대상종의 특성 43
가. 큰물벼룩(Daphnia magna, 물벼룩과) 43
(1) 일반특성 및 생태 43
나. 화랑곡나방(Plodia interpunctella, 명나방과) 45
(1) 일반특성 및 생태 45
다. 조명나방(Ostrinia furnacalis, 명나방과) 46
(1) 일반특성 및 생태 46
라. 꼬리명주나비(Sericinus montela, 호랑나비과) 48
(1) 일반특성 및 생태 48
마. 꿀벌(Apis mellifera, 꿀벌과) 50
(1) 일반특성 및 생태 50
바. 초파리(Drosophila melanogaster, 파리목 초파리과) 51
(1) 일반특성 및 생태 51
사. 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans, 신생선충속 원충목) 52
(1) 일반특성 및 생태 52
6. dsRNA 위해성 평가를 위한 평가대상종 사육 및 실험방법 53
가. 물벼룩 사육 및 실험방법 53
나. 화랑곡나방 사육 및 실험방법 54
다. 조명나방 사육 및 실험방법 55
라. 꼬리명주나비 사육 및 실험방법 57
마. 꿀벌 사육 및 실험방법 59
바. 초파리 사육 및 실험방법 59
사. 예쁜꼬마선충 사육 및 실험방법 60
Ⅲ. 연구결과 및 고찰 62
1. RNase A 처리에 따른 dsRNA의 분해 62
2. ssRNA 분해를 위한 조건 확인 63
3. RNase A의 농도별과 온도별 처리 조건 확립 64
4. RNase A와 DNase I처리 조건 확립 66
5. Snf7과 GFP dsRNA의 농도 증가에 따른 조건 확립 68
6. dsRNA의 상온에서 안전성 확인 70
7. 식물세포내 일시발현을 위한 Snf7과 GFP의 클로닝 확인 71
8. 일시적 발현된 담배의 RNA확인 72
9. Northern Blot 조건 확립 75
10. 위해성 평가 결과 78
가. 큰물벼룩 위해성 평가 결과 78
나. 화랑곡나방 위해성 평가 결과 79
다. 조명나방 위해성 평가 결과 81
라. 꼬리명주나비 위해성 평가 결과 83
마. 꿀벌 위해성 평가 결과 85
바. 초파리 위해성 평가 결과 86
사. 예쁜꼬마선충 위해성 평가 결과 88
Ⅳ. 결론 90
참고문헌 92
[부록 1] 97
표 1. 유전자변형작물의 2016년 국가별 재배면적 24
표 2. cDNA 합성을 위한 반응액 조성 37
표 3. cDNA 합성을 위한 PCR 반응 조건 37
표 4. qRT-PCR을 위한 프라이머 정보 38
표 5. Biotin 부착을 위한 PCR 반응액 조성 40
표 6. biotin 부착을 위한 PCR 조건표 40
표 7. DIG 부착을 위한 PCR 반응액 조성 40
표 8. DIG 부착을 위한 PCR 조건표 40
표 9. 믈벼룩의 누적 유영저해개체수 78
표 10. 물벼룩의 일반중독증상 78
표 11. 꿀벌의 누적 치사수 86
표 12. 꿀벌의 일반 중독증상 86
그림 1. 세계유전자변형작물 재배면적(농업생명공학정보한국센터; ISAAA Brief, No 52) 23
그림 2. 유전자변형작물별 재배면적 현황(농업생명공학정보한국센터; ISAAA Brief, No 52) 25
그림 3. 형질별 LMO 재배면적 26
그림 4. 최근 국내ㆍ외 바이오안전성 및 연구개발 현황 26
그림 5. dsRNA 발현 플라스미드 모식도. (A) pCAMBIA1300 벡터를 이용한 클로닝 모식도 (B) pK7GWIW(2) 벡터 벡터를 이용한 클로닝 모식도 (C) pHellsgate12... 35
그림 6. qRT-PCR반응 조건 모식도(국립생태원, 2016) 39
그림 7. 큰물벼룩 암컷성체의 모습 44
그림 8. 물벼룩 단위생식과 수정생식의 과정 45
그림 9. 화랑곡나방 변태과정. (A) 알 (B) 애벌레 (C) 번데기 (D) 성충 (E) 우화한 성충 (F) 전 번데기(국립생태원, 2016) 46
그림 10. 조명나방의 모습. (A) 애벌레 (B) 성충 47
그림 11. 조명나방 변태과정. (A) 알 (B) 애벌레 (C) 번데기 (D) 성충 48
그림 12. 꼬리명주나비의 표본사진 (A) 수컷 등면 (B) 암컷 등면 49
그림 13. 꼬리명주나비의 알과 유충. (A) 검은 색을 띠는 알의 모습 (B) 알에서 부화한 1령 유충 (C) 먹이를 먹는 1령 유충 49
그림 14. 꼬리명주나비 번데기 50
그림 15. 초파리 암수구별. (A) 수컷 초파리 (B) 암컷 초파리 51
그림 16. 예쁜꼬마선충 암수한몸(hermaphrodite)성체의 모습 52
그림 17. 예쁜꼬마선충의 생활사 53
그림 18. 물벼룩 사육 및 위해성 평가 54
그림 19. 화랑곡나방 실험과정. (A) 실험곤충 선발 (B) 시험물질 혼합 방법 (C) 화랑곡나방의 시험물질 섭식 (D) 시험 진행인 페트리디쉬 55
그림 20. 조명나방 실험과정. (A) 실험곤충 사육 및 선발 (B) 시험물질 혼합 (C) 조명나방의 시험물질 섭식 (D) 시험 진행 56
그림 21. 꼬리명주나비 인공사육 및 실험과정. (A) 실험곤충의 알 (B) 애벌레 인공사육 (C) 시험불질 분무 (D) 시험 물질 섭식 58
그림 22. 꼬리명주나비 실험. (A) GFP dsRNA 섭식 (B) Snf7 dsRNA 섭식 58
그림 23. 꿀벌 사육 방법 및 실험시료 처리 방법. (A) 시험물질 처리 (B) 시험 실시(국립생태원., 2016) 59
그림 24. 초파리 실험 방법. (A) 순수분리 정제한 dsRNA 시험물질 혼합 (B) 암수 구분을 위한 초파리 마취 (C) 초파리 실험 60
그림 25. 선충 실험 방법. (A) 순수분리 정제한 dsRNA 시험물질 혼합 (B) 선충 선별 61
그림 26. RNase A 농도별 처리 결과. (A) GFP total RNA에 RNase A를 농도별로 상온에서 처리 (B) Snf7 total RNA에 RNase A를 농도별로 상온에서 처리. 흰색... 62
그림 27. 0.5 M NaCl과 함께 처리한 RNase A 농도별 처리. (A) GFP total RNA의 RNase A농도별로 얼음에서 처리 (B) Snf7 total RNA의 RNase A 농도별로 얼음에서... 63
그림 28. 얼음에서 RNase A 농도별 처리 확인. (A) GFP total RNA의 RNase A농도별로 얼음에서 10분 동안 처리 (B) Snf7 total RNA의 RNase A농도별로 얼음에서... 64
그림 29. 상온에서 RNase A 농도별 처리 확인. (A) GFP total RNA의 RNase A농도별로 상온에서 10분 동안 처리 (B) Snf7 total RNA의 RNase A농도별로 상온에서... 65
그림 30. 37℃ 에서 RNase A 농도별 처리 확인. (A) GFP total RNA의 RNase A농도별로 37℃에서 처리 (B) Snf7 total RNA의 RNase A농도별로 37℃에서 처리. 흰색... 66
그림 31. GFP에서 RNase A와 DNase I 확인. (A) GFP total RNA에 RNase A 50㎍/㎖의 농도로 37℃에서 시간별로 처리 (B) GFP total RNA에 RNase A 50㎍/㎖와... 67
그림 32. Snf7에서 RNase A와 DNase I 확인. (A) Snf7 total RNA에 RNase A 50㎍/㎖의 농도로 37℃에서 시간별로 처리 (B) Snf7 total RNA에 RNase A 50㎍/㎖와... 68
그림 33. RNA농도 증가에 따른 정제 조건. (A) RNase A와 DNase I처리 직후 RNA. 흰색 화살표는 dsRNA를 나타냄. (B) 에탄올을 이용하여 RNA침전 실시 한 RNA 69
그림 34. RNA농도 증가에 따른 정제 조건. (A) RNase A와 DNase I처리 전 total RNA (B) RNase A와 DNase I처리 직후 RNA (C) 100% 에탄올을 이용하여 RNA침전 실시 한 RNA 69
그림 35. dsRNA의 상온에서 안전성 확인. (A) 0.1% DEPC용액에 녹인 total RNA (B) RNase Free water에 정제한 dsRNA (C) 0.1% DEPC용액에 녹인 dsRNA. 흰색 화살표는 dsRNA를 나타냄 71
그림 36. Snf7과 GFP 클로닝 확인을 위한 PCR결과 71
그림 37. 일시발현 담배에서 GFP와 Snf7 dsRNA량 변화 확인 72
그림 38. Q-PCR에서 GFP의 dsRNA량 변화 확인. (A) GFP specific primer 증폭 결과(76bp) (B) GFP specific primer 증폭 결과(100bp) 72
그림 39. Q-PCR에서 Snf7의 dsRNA량 변화 확인. (A) Snf7 specific primer 증폭 결과(92 bp) (B) Snf7 specific primer 증폭 결과(100 bp). 대조군은 일시적 발현시키지... 73
그림 40. Q-PCR에서 GFP의 dsRNA량 변화 확인. (A) 세포주 GV3101의 벡터차이에 따른 GFP specific primer 증폭 결과 (B) 세포주 EHA의 벡터차이에 따른 GFP... 74
그림 41. Q-PCR에서 Snf7의 dsRNA량 변화 확인. (A) 세포주 GV3101의 벡터차이에 따른 Snf7 specific primer 증폭 결과 (B) 세포주 EHA의 벡터차이에 따른 Snf7... 75
그림 42. Snf7 PCR과 Northern blot결과. (A) biotin이 표지된 Snf7 PCR (B) Snf7 PCR probe를 이용한 Northern blot 결과. 붉은색 화살표가 dsRNA의 밴드 부분을 나타냄 76
그림 43. Snf7 DNA에서 biotin이 표지된 Snf7를 이용한 Northern blot결과. (A) Snf7 DNA 부피별 전기영동 (B) Biotin이 표지된 Snf7 probe를 이용한 Northern blot 결과 76
그림 44. DIG가 표지된 Snf7의 Northern blot을 위한 전기영동결과. (A) GFP와 Snf7 DNA 전기영동 사진 (B) DIG가 표지된 Snf7의 Northern blot결과 77
그림 45. 화랑곡나방 사망개체수 79
그림 46. 화랑곡나방 반복횟수 사망률 80
그림 47. 화랑곡나방 일일 사망 개체수 80
그림 48. 화랑곡나방 누적사망 개체수 80
그림 49. 화랑곡나방 유충 평균 소요일수 81
그림 50. 조명나방 사망개체수 82
그림 51. 조명나방 반복횟수 사망률 82
그림 52. 조명나방 일일 사망 개체수 82
그림 53. 조명나방 누적 사망 개체수 83
그림 54. 화랑곡나방 유충 평균 소요일수 83
그림 55. 꼬리명주나비 사망개체수 84
그림 56. 꼬리명주나비 반복횟수 사망률 84
그림 57. 꼬리명주나비 일일 사망 개체수 84
그림 58. 꼬리명주나비 누적 사망 개체수 85
그림 59. 꼬리명주나비 유충 평균 소요일수 85
그림 60. 초파리의 번데기와 성충 우화수 평균 87
그림 61. 초파리의 성충 우화율 87
그림 62. 초파리의 암수 마릿수 88
그림 63. 선충의 자손 수. GFP와 Snf7 dsRNA는 0.1㎍/㎖의 농도로 처리 88
그림 64. GFP와 Snf7 dsRNA의 독성영향에 대한 선충의 수 89