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Title Page

Contents

Abstract 9

Chapter 1. INTRODUCTION 10

1.1. Definition and risk of obesity and T2DM 10

1.2. T2DM 11

1.3. PPP5 12

Chapter 2. Material and Methods 14

2.1. Overexpression and Purification of Recombinant PPP5 14

2.2. Half-Maximal Inhibitory Concentration (IC50) Determination 15

2.3. RNA interference 16

2.4. Quantitative Real Time-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) 16

2.5. Cell Culture and Differentiation Mouse 3T3-L1 pre-adipocytes 17

2.6. Glucose uptake assays 19

2.7. Western Blotting 20

2.8. Oil Red O Staining 21

2.9. Statistical Analysis 21

Chapter 3. Results 22

3.1. The path to discovering natural products that inhibit PPP5 22

3.2. Suppression of PPP5 increased obesity and diabetes marker 25

3.3. Norcantharidin derivatives 28

3.4. The cytotoxicity of NCT in 3T3-L1 30

3.5. Norcantharidin downregulated the adipogenic transcriptional Factors 31

3.6. Treatment with Norcantharidin increases p-AMPK and p-AKT levels 33

3.7. Glucose uptake is increased following NCT treatment 34

3.8. Effects of NCT on lipid accumulation of 3T3-L1 35

Chapter 4. Conclusion 37

References 39

논문요약 40

List of Tables

Table 1. Kinetic constants for DiFMUP hydrolysis by PPP5 23

List of Figures

Figure 1. Purified proteins according to the affinity tag, enzyme kinetics SDS-PAGE analysis of PPP5 using affinity chromatography column, TALON... 23

Figure 2. Knockdown Efficiency of PPP5 was determined by qRT-PCR and We transfected siRNA with PPP5 for 48h using 3T3-L1 pre-adipocyte(A).... 26

Figure 3. PPP5 Knock down using siRNA. We proceeded to knock down using siRNAs designed from the PPP5 sequence... 27

Figure 4. Knockdown of PPP5 shows anti-obesity and anti-diabetic effects. After PPP5 knock down, PPARγ marker confirmed by western blot.(A,B)... 27

Figure 5. NCT derivatives and inhibition percentages. The graph (A,B) summarizes the inhibition under the conditions of PPP5... 29

Figure 6. Cell viability assay cytotoxicity of Norcantharidin. Cytotoxicity of Norcantharidin on 3T3-L1 adipocyte. Cell viability was... 30

Figure 7. NCTs in 3T3-L1 were treated by concentration.The anti-obesity markers PPARγ and CEBPα were subsequently confirmed by western blot... 32

Figure 8. Concentration-specific treatment of NCT increases AMPK phosphorylation. Phosphorylation of AMPK, a diabetes marker, and AKT... 33

Figure 9. NCT improves glucose uptake ability in differentiated 3T3-L1. 3T3-L1 was incubated with NCT (5, 10 μM)or 100 nM insulin as a positive... 34

Figure 10. NCT inhibits lipid accumulation. Treatment of 3T3-L1 with NCTs at different concentrations (0.5, 1, 2, 5 μM) showed a concentration-... 35

Figure 11. Using the Oil Red O assay, we show that treatment of NCTs early in 3T3-L1 differentiation inhibits lipid accumulation more than treatment late... 36

초록보기

 비만은 지방조직에 과도한 지방이 축적된 상태이며 일정수준 이상의 음식 섭취 및 활동량 감소가 원인으로 에너지 불균형을 야기하면서, 체지방이 증가되어 생기며, 당뇨병은 인슐린 기능의 이상이나 인슐린이 부족하여, 포도당이 혈액에 남아서 혈당을 높이는 동시에 여러가지 다양한 합병증을 일으키는 질환입니다. 이러한 대사질병은 인종 연령, 생활습관, 유전적 요인, 식습관 등의 다양한 위험 요인이 복합적으로 연관되어 한 가지 요인만으로 대사질병의 원인으로 꼽기는 어렵습니다. 이러한 대사적 질병의 증상을 완화 또는 치료하기 위해서 다양한 시도가 계속되고 있는데요, 그중 TZDs 등의 합성치료제도 존재하지만, 이보다 부작용이 적은 천연물을 이용한 약물 발굴 연구 또한 활발하게 이루어지고 있습니다. 이에 발맞춰, 저희는 신약후보물질 1152종에 대하여 여러 STP와의 억제정도를 스크리닝하였습니다. 그 결과, Norcantharidin 물질을 발견하였고, 이는 lipid accumulation, mRNA수준에서 항비만, 항당뇨 효능의 가능성을 가지며, glucose uptake 등을 개선하는 효능을 보였습니다. 우리는 이를 증명하기 위해서 인슐린의 활용이나, 지질운용 정도가 가장 높은 3T3-L1 세포주를 선택하여 실험 진행하였습니다. 이를 통해 PPP5의 mRNA, protein level 마지막으로 pheonotype 측면에서의 제거가 항비만 항당뇨적 효능을 보이는 것을 확인하였습니다. 관련된 시그널 측면에서 보자면, AMPK 시그널이 PPP5의 억제에 의해 활성화되면서 Glucose uptake의 개선능을 보였습니다. PPARγ 시그널에서 또한 PPP5가 억제되면서, lipid accumulation을 저해하는 것을 알 수 있습니다. 이어서 이러한 PPP5를 억제하는 NCT를 농도별로 3T3-L1에 처리한 결과, 유의미하게 지질을 억제하는 효능을 보였습니다. 앞서 말한 Norcantharidin물질은 이후 복합 투여 등의 주입방식을 통해 부작용이 보다 더 적은 대사질환 치료제로서의 가능성을 제안해볼 수 있다.

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