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표제지

국문 요약

목차

1. 서론 9

1.1. 배경 지식 9

1.1.1. 표피의 구조와 의의 9

1.1.2. SC layer와 corneocytes 11

1.1.3. Filaggrin (FLG) degradation & Natural moisturizing factor (NMF) 14

1.1.4. Pro-inflammatory cytokine & inflammation 14

1.1.5. corticosteroids & non-steroidal anti-inflammatory drugs (NASIDs) 16

1.1.6. Phytosphingosine (PY) & phytoceramide (phytoCer) 17

1.1.7. PY 유도체 (PCA-PY & Betaine-PY) 20

1.1.8. 탁도 (Turbidity)을 이용한 용해도 측정 22

1.2. 이전 연구 23

1.3. 연구의 목적 23

2. 시약 및 방법 25

2.1. 시약 25

2.2. 세포 배양 및 처리 27

2.2.1. Normal human epidermal keratinocytes (NHEKn) 27

2.2.2. HaCaT 27

2.3. Cell viability assay (MTT assay) 28

2.4. Quantitative real-time PCR 30

2.5. NHEK의 지질 추출 및 high performance of thin layer chromatography(HPTLC) 32

2.5.1. 배양한 NHEK에서의 지질 추출 32

2.5.2. HPTLC 33

2.6. Nephelometry solubility assay 33

3. 결과 35

3.1. PY와 PCA-PY의 세포 독성 비교(MTT assay) 35

3.2. PCA-PY에 의한 keratinocytes 각화 촉진(brick의 형성) 36

3.2.1. Normal human epidermal keratinocyte에서의 TGase-1 유전자 발현 증대 37

3.2.2. Normal human epidermal keratinocyte에서의 Involucrin 유전자 발현 증대 38

3.2.3. Normal human epidermal keratinocyte에서의 Caspase-14 유전자 발현 증대 39

3.3. PCA-PY에 의한 NP ceramide 합성 증대(mortar의 형성) 40

3.4. PCA-PY에 의한 HaCaT cell line에서의 염증반응 억제 42

3.4.1. HaCaT에서의 TNF-α 유전자 발현 결과 43

3.4.2. HaCaT에서의 COX-2 유전자 발현 결과 44

3.5. PY와 PCA-PY의 용해도 비교 45

4. 고찰 46

참고문헌 48

ABSTRACT 56

표목차

표 1. 15종의 ceramide의 표, S: Sphingosine, P: phytosphingosine, H: 6-hydroxysphingosine, DS: sphinganine, 열은 fatty acid의 종류를... 19

표 2. 실험에 사용한 Primer 목록 31

표 3. PY와 PCA-PY의 RNU의 평균값과 그 둘의 차이 45

그림목차

그림 1. 표피를 구성하는 요소의 위치와 층의 구분 10

그림 2. 최종 형태의 brick과 mortar의 형성과 대략적인 구조 13

그림 3. sphingoid base의 종류와 구조 (A)sphingosine, (B)dihydrosphingosine(sphinganine), (C)phytosphingosine, (D)6-hydroxysphingosine 18

그림 4. human SC에서의 phytoceramide 함량 비율 19

그림 5. 유도체 합성에 쓰인 아미노산의 구조, (A) Pyrrolidon carboxylic acid, (B) Glycine, (C) Betaine 20

그림 6. PY 유도체들의 분자 구조, (A) pyrrolidone carboxylic acid-phytosphingosine (PCA-PY), (B) Betaine-phytosphingosine (Betaine-PY) 21

그림 7. NEPHELOstarplus의 측정 원리 우측 그림처럼 부유물이 존재하면 photodetector에 감지되는 빛이 늘어나게 되고 RNU 값도 커지게 된다.[이미지참조] 22

그림 8. mitochondrial reductase에 의한 MTT reaction 29

그림 9. PY와 PCA-PY가 NHEK에 미치는 독성 검사 결과 35

그림 10. NHEK를 각 조건으로 처리한 후 24 시간을 배양하고 얻은 mRNA로부터 qRT-PCR을 진행하여 얻은 데이터 (p〈0.05 *, p〈0.01 **,... 37

그림 11. NHEK를 각 조건으로 처리한 후 24 시간을 배양하고 얻은 mRNA로부터 qRT-PCR을 진행하여 얻은 데이터 (p〈0.05 *, p〈0.01 **,... 38

그림 12. NHEK를 각 조건으로 처리한 후 24 시간을 배양하고 얻은 mRNA로부터 qRT-PCR을 진행하여 얻은 데이터 (p〈0.05 *, p〈0.01 **,... 39

그림 13. NHEK를 7 일간 PY 2uM, PCA-PY 0.5uM, PCA-PY 1uM, PCA-PY 2uM로 처리한 후 추출한 지질로 HPTLC plate에 전개... 41

그림 14. HaCaT cell을 각 조건으로 24 시간 처리한 후 얻은 mRNA로부터 qRT-PCR을 진행하여 얻은 데이터 (p〈0.05 *, p〈0.01 **,... 43

그림 15. HaCaT cell을 각 조건으로 24 시간 처리한 후 얻은 mRNA로부터 qRT-PCR을 진행하여 얻은 데이터 (p〈0.05 *, p〈0.01 **,... 44

초록보기

 Natural Moisturizing Factor (NMF)의 주요성분 가운데 하나인 Pyrrolidone Carboxylic Acid (PCA)의 카르복실기 (carboxyl group)와 파이토스핑고신 (PY, phytosphingosine)의 아민기 (amine group)가 결합하여 합성된 물질을 PCA-PY 라 명명하였다. 본 연구에서는 PCA-PY 와 파이토스핑고신의 특성을 비교분석하였다.

물리적인 특성으로 분자량은 428.61 g/mol 이며 PY 와 마찬가지로 물에는 잘 용해되지 않지만 dimethyl sulfoxide (DMSO)에는 용해되는 특징이 있다. Normal human epidermal keratinocyte (NHEK)에 PY 을 처리 한 실험에서는 keratinocyte의 분화와 관련된transglutaminase-1 (TGase-1), involucrin (INV)등의 인자와 filaggrin (FLG, filament aggregating protein) 분해와 NMF 형성에 관련된 효소인 caspase-14, bleomycin hydrolase (BLMH) 등이 음성 대조군 대비 증가되었음을 확인하였다. ceramide 는 sphingoid base 의 amine group 과 지방산 (fatty acid)의 carboxyl group 이 결합하여 생성되는데 Sphingoid base 부분이 PY 이면 NP, AP, EOP 등의 phytoceramide 계열로 분류된다. NHEK 에 PY 을 처리했을 때 phytoceramide 중에서도 NP 가 가장 우세하게 합성 되었음을 확인하였다. 사람 피부에 PY 을 2 주간 도포 한 실험에서는 tape stripping 법으로 채취한 샘플 내에서의 PCA, trans-UCA의 양을 조사하였고 음성 대조군 대비 증가한 것을 확인하였다.

이번 연구에서는 PCA-PY 가 각질형성세포(keratinocyte)와 인간 피부에 미치는 영향과 효능을 평가하였다. 우선 세포독성을 조사하였고 PY 의 효능을 평가하기 위해 수행했던 실험 조건을 동일하게 PCA-PY 처리 실험에도 적용하여 결과를 얻어내었고 PY 처리 실험에서 얻은 결과와 비교하였다. 그리고 이전 실험에서 진행하지 않았던 항 염증 효능(anti-inflammatory effect)을 검증하기 위한 실험도 진행하여 효능이 보고되었던 PY 와 비교해 보았다. In vitro 실험에 쓰일 샘플 용액을 만들 때 PY 는 DMSO 에 녹이는 과정 중 가온(加溫)이 필요할 정도로 용해가 잘 되지 않았지만 PCA-PY 는 별도의 가온(加溫) 없이 용해가 되었다. 두 물질의 용해도 차이를 구체적인 수치로 제시하기 위해 용해도 측정 실험도 진행하였다.

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