목차

[표제지 등]=0,1,2

최종보고서=0,3,1

제출문=1,4,1

요약문[파오손면;p.11]=2,5,11

목차=13,16,5

제1장 서론=18,21,1

제1절 연구개발 목적 및 범위=18,21,1

1. 연구개발의 목적=18,21,2

2. 연구개발의 내용=19,22,1

가) PCR방법에 의한 Listeria 신속검출법의 개발=19,22,1

나) PCR방법에 의한 Listeria 확정검사법의 개발=19,22,1

다) 재조합 DNA방법에 의한 Listeria 특이항원단백질의 생산=19,22,1

라) Listeria효소면역검사법을 위한 polyclonal 항체의 생산=19,22,2

마) Listeria효소면역검사법을 위한 monoclonal 항체의 생산=20,23,1

바) Listeria효소면역검사법에 의한 실험실적 검사법의 개발=20,23,1

사) Listeria효소면역검사법에 의한 야외간이 검사법의 개발=20,23,1

아) Liateria 분리동정에서 공인 표준검사법 및 수입 검출키트들과 개발된 신속검출법의 비교실험=20,23,1

제2절 연구개발 배경=21,24,1

1. 리스테리아 검색의 기술적 측면=21,24,6

2. 리스테리아 검색의 경제ㆍ산업적 측면=26,29,2

3. 리스데리아 검색의 사회ㆍ문화적측면=27,30,2

제3절 국내외 리스테리아 검색키트들=29,32,1

1. 국내외 리스테리아 검색기술의 수준=29,32,3

2. 앞으로의 전망=31,34,2

제2장 Listeria spp. PCR 검출 kit=33,36,1

제1절 서설=33,36,1

제2절 Listeria PCR 검출 kit의 제조=33,36,1

1. 공시균주=33,36,2

2. oligonucleotide primers=34,37,2

3. Listeria Multiplex PCR의 표준균주에서의 효율성 확인=36,39,2

4. L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri의 검출을 위한 SlW III Multiplex PCR=37,40,2

5. Gradient PCR을 이용한 L.ivanovii의 최적 검출 조건 검사=38,41,2

6. Listerisa Multiplex PCR 반응을 위한 Chromosomal DNA isolation Method 비교=40,43,3

7. 식품에 대한 multiplex PCR 검출법의 효율성 검사=42,45,2

8. 우유에서의 PCR 검출법=43,46,1

가. 우유에서의 PCR 검출 효율성 검사=43,46,2

나. 우유로부터 원심분리 rpm에 따른 L. monocytogenesis의 회수율 검사=44,47,2

다. 우유에서 L. monocytogenes의 균수에 따른 PCR 반응 검출의 한계=45,48,2

라. PCR 표준 반응조건=46,49,1

제3장 Listeria spp. 항원 생산=47,50,1

제1절 서설=47,50,2

제2절 Listeria spp. 재조합 p60 단백질 항원 생산=48,51,1

1. p60단백질 유전자 클로닝=48,51,1

가. Listeria spp. 균주의 배양 및 genomic DNA 순수분리=48,51,2

나. iap gene PCR 증폭 및 T-vector cloning=49,52,2

다. pMAL-c2 발현 vector에 subcloning=51,54,4

2. Listeria spp. 재조합 p60 단백질의 발현=54,57,1

가. 재조합 p60 단백질 발현조건 비교=54,57,1

1) MBP-p60/mono의 발현=54,57,1

가) IPTG 농도에 따른 MBP-p60/mono의 발현 조건비교=54,57,2

나) Induction 시간에 따른 MBP-p60/mono의 발현 조건=55,58,2

2) MBP-p60/grayi의 발현=56,59,3

3) 그 밖의 Listeria p60 재조합 단백질의 발현=58,61,4

3. 재조합 p60 단백질 대량생산 및 정제=61,64,1

가. 재조합 DNA로부터 얻어진 MBP-p60/mono와 MBP-p60/iva 단백질의 정제=61,64,2

나. 재조합 DNA로부터 얻어진 MBP-p60/grayi 단백질의 정제=62,65,2

4. 단백질 농축=64,67,1

5. 세포외 단백질 농축=64,67,1

제3절 Listeria Flagella 항원생산=64,67,1

1. 배양=64,67,2

2. 편모분리=65,68,1

3. 항원의 확인=65,68,1

가. SDS-PAGE=65,68,1

1) flagella의 SDS-PAGE=65,68,2

나. flagella의 발현=66,69,1

1) SEM(Scanning Electron Microscope)=66,69,2

2) TEM(Transmission Electron Microscope)=68,71,1

가) 초원심분리를 이용한 flagella의 정제=68,71,1

제4장 Listeria 항체 생산 및 ELISA, Rapid Kit 제작=69,72,1

제1절 서설=69,72,2

제2절 Lsteria monocytoenes anti-p60 단일클론 항체 제작=70,73,1

1. Listeria monocytoenes anti-p60 단일클론 항체 제작=70,73,1

가. Listeria monocytogenes 재조합 p60 항원 단백질 면역 주사=70,73,2

나. ELISA test=71,74,2

다. 동물세포 배양=72,75,1

1) Cell의 보관=72,75,1

2) cell의 해빙=72,75,2

3) Cell counting(Hemacytometer)=73,76,1

4) 세포의 유지배양=73,76,1

라. B-Lymphocyte와 myeloma cell의 융합=73,76,3

마. anti-MBP/p60 IgG를 생산하는 hybridoma cell의 선별=75,78,4

1) 선별된 hybridoma cell의 상등액을 이용한 ELISA=78,81,2

2) Hybridome의 상등액을 이용한 재조합 p60단백질의 Western detection=79,82,3

3) 선별된 hybridoma의 상등액을 이용한 재조합 p60 단백질의 ELISA=81,84,3

바. 제한 희석법을 통한 anti-MBP-p60/mono 단일클론항체의 선별=83,86,1

2. 단일클론항체의 Listeria monocytogenes 특이적 역가 test=84,87,1

가. 선별된 hybridoma를 이용한 L. monocytogenes의 세포의 단백질 p60의 ELlSA=84,87,3

나. 선별된 hybridoma를 이용한 Listeria spp. 에 대한 p60단백질의 ELISA=86,89,4

다. 선별된 hybridoma를 이용한 Listeria spp. 에 대한 p60단백질의 Western blot=89,92,3

라. Ascite fluid 제작=91,94,2

제3절 Listeria Flagella 항체제조=92,95,1

1. 다클론항체=92,95,1

가. Rabbit polyclonal antibody=92,95,1

나. Chick yolk antibody(IgY)의 생산 및 분리=92,95,2

1) IgY 역가 변화=93,96,1

2) IgY의 SDS-PAGE=93,96,2

2. 단클론항체의 생산=94,97,1

가. Listeria monocytogenes 4b의 flagella에 대한 Mabs의 생산=94,97,2

나. 항체가 측정을 위한 ELlSA=95,98,1

다. 단클론항체의 복수생산=95,98,2

라. 항체의 정제=96,99,1

3. Sandwich ELISA의 개발=96,99,1

가. 교차반응 조사=96,99,2

나. HRP labelled 항체(detector항체)의 제작=97,100,1

1) Detector항체 역가=97,100,1

다. Capture항체와 detector항체의 조합조건=98,101,1

1) Capture항체와 detector항체의 조합조건=98,101,2

라. 특이도 조사=99,102,2

마. 민감도 조사=100,103,2

4. Lateral flow rapid kit의 개발=102,105,1

가. Colloidal gold=102,105,1

나. Colloidal gold-항체 중합체 제작=102,105,1

다. Lateral flow rapid kit의 구성=102,105,2

1) Lateral flow rapid kit의 구성=103,106,1

라. Capture항체와 detector항체의 조합조건=103,106,2

마. 교차반응=104,107,2

바. 특이도=105,108,2

사. 민감도=106,109,2

제5장 개발된 검색키트와 표준검사법 및 상용키트와의 비교실험=108,111,1

제1절 서설=108,111,1

제2절 표준검사법 및 균주의 확보=108,111,1

1. 시료 채취=108,111,1

2. 검사방법=108,111,1

가. 균분리 및 보관=108,111,8

제3절 개발된 키트들과 수입키트간의 비교검사=115,118,1

1. 개발된 키트와 수입키트간의 비교검사=115,118,2

가. 수입키트들의 검출한계 조사=116,119,1

나. 수입키트들의 L. monocytogenes 종동정 성능=117,120,1

2. 세계 각국에서 유래된 Listeria 균주들에 대한 개발 키트의 적용실험=117,120,2

제6장 참고자료 및 문헌=119,122,7

영문목차

[title page etc.]=0,1,7

Summary=5,8,3

Contents[파오손면;p.11]=8,11,10

Chapter1 Introduction=18,21,1

Section1 Purpose and the details of research=18,21,1

1. Purpose of project=18,21,2

2. The details of project=19,22,1

A. The development of Listeria rapid detection by using PCR=19,22,1

B. The development of Listeria species confirmation detection by using PCR=19,22,1

C. The production of Listeria specific antigen protein by using recombinant DNA technique=19,22,1

D. The production of polyclonal antibody for the Listeria ELISA test=19,22,2

E. The production of monoclonal antibody for the Listeria ELISA test=20,23,1

F. The development of Listeria ELISA system for lab-scale=20,23,1

G. The development of immunochromatographic method for the field test=20,23,1

H. Standard method for the isolation of Listeria spp. and the comparative test between developed kits and imported kits=20,23,1

Section2 Background of development=21,24,1

1. Technical views in listerial detection=21,24,6

2. Economic and industrial views in listerial detection=26,29,2

3. Social and cultural views in listerial detection=27,30,2

Section3 Listeria detection kits in land and imported=29,32,1

1. Technical levels of listerial detection in land=29,32,3

2. Aspects and now what?=31,34,2

Chapter2 Listeria spp. PCR detection kit=33,36,1

Section1 Introduction=33,36,1

Section2 The development of Listeria PCR detection kit=33,36,1

1. Listeria strains=33,36,2

2. Oligonucleotide primers=34,37,2

3. The efficiency of detection of Listeria Multiplex PCR with type strains=36,39,2

4. SIW III Multiplex PCR for the detection of L.ivanovii, L.seeligeri, L.welshimeri=37,40,2

5. The best condition of L.ivanovii detection using Gradient PCR=38,41,2

6. The comparative Lest of chromosomal DNA isolation Methods for the Listeria Multiplex PCR=40,43,3

7. The efficiency of detection using Multiplex PCR in food-samples=42,45,2

8. PCR dctection in milk-samples=43,46,1

A. The efficiency of detection using PCR in Milk-samples=43,46,2

B. The recovery-rate of L.monocytogenes from milk usirlg centrifugation=44,47,2

C. The PCR detection limit of L.monocytogenes in milk=45,48,2

D. Optimal conditions for the best PCR detection=46,49,1

Chapter3 Antigen production of Listeria spp.=47,50,1

Section1 Introduction=47,50,2

Section2 The recombinant p60 antigen of Listeria=48,51,1

1. Molecular cloning of p60 protein=48,51,1

A. Culture of Listeria spp. and purification of genomic DNA=48,51,2

B. Amplifcation of iap gene using PCR and T-vector cloning=49,52,2

C. Subcloning into pMAL-c2 expression vector=51,54,4

2. Expression of recombinant Listeria spp. p60 protein=54,57,1

A. Comparative test for expression-condition of recombinant p60 protein=54,57,1

1) Expression of MBP-p60/mono=54,57,1

a) IPTG concentration in expression of MBP-p60/mono=54,57,2

b) Induction time in expression of MBP-p60/mono=55,58,2

2) Expression of MBP p60/grayi=56,59,3

3) Expression of other Listeria p60 recombinant proteins=58,61,4

3. Mass production of recombinant p60 protein and its purification=61,64,1

A. Purification of MBP-p60/mono and MBP-p60/iva proteins=61,64,2

B. Purification of MBP-p60/grayi proteins=62,65,2

4. Prodtein concentration=64,67,1

5. Concentraion of extracellular protein=64,67,1

Section3 Flagella antigen production of Listeria spp=64,67,1

1. Culture=64,67,2

2. Isolation of flagella=65,68,1

3. Identification of antigen=65,68,1

A. SDS-PAGE=65,68,1

1) fIagella protein in SDS-PAGE=65,68,2

B. Expression of flagella=66,69,1

1) SEM(Scanning Electron Microscope)=66,69,2

2) TEM(Transmission EIectron Microscope)=68,71,1

A) Purification of flagella using ultracentrifuge=68,71,1

Chapter4 AntiListeria antibody production and the production of ELISA kit and rapid kit=69,72,1

Section1 Introduction=69,72,2

Section2 The production of anti-p60 monoclonal antibody=70,73,1

1. Monoclonal antibody of Listeria monocytogenes anti-p60=70,73,1

A. Immunization of Listeria monocytogenes recombinant p60 antigen=70,73,2

B. ELISA test=71,74,2

C. Animal cell culture=72,75,1

1) Strage of Cell=72,75,1

2) Recovery of Cell=72,75,2

3) Cell counting (Hemacytometer)=73,76,1

4) Subculture of cell line=73,76,29

4.=102,105,1

A. Colloidal gold=102,105,1

B. Production of Colloidal gold-antibody polmer=102,105,1

C. Construction of Lateral flow rapid kit=102,105,2

1) Construction of Lateral now rapid kit=103,106,1

D. Combination-conditions between Capture AB and detector AB=103,106,2

E. Cross-reaction=104,107,2

F. Soecificity=105,108,2

G. Sensitivity=106,109,2

Chapter5 Comparative test between developed kits and Commerical kits=108,111,1

Section1 Introduction=108,111,1

Section2 Standard test and collection of strains=108,111,1

1. Sample collection=108,111,1

2. test methods=108,111,1

A. Isolation and storage of strains=108,111,8

Section3 Comparative test between developed kits and commerical kits=115,118,1

1. Comparative test between developed kits and commerical kits=115,118,2

A. Detection limit of commerical kits=116,119,1

B. Species-identification of L. monocytogenes using commerical kits=117,120,1

2. Application test of developed kits with strains isolated from over the world=117,120,2

Chapter6 Reference=119,122,7